酵母表面展示荧光蛋白复合物的单细胞分析及其在人工纤维素酶体设计中的应用

这篇研究通过构建荧光蛋白复合物（FPC）模拟人工纤维素酶体（DC）结构，首次采用流式细胞术和共聚焦显微镜技术，在单细胞水平系统评估了酿酒酵母（S. cerevisiae）作为DC表达宿主的效率瓶颈。研究发现酵母共表达支架蛋白（scaffoldin）与对接蛋白（FDP）时存在显著代谢负担，导致仅9.19%细胞能完成自组装，而合成酵母联盟（consortium）策略可显著提升组装效率。该工作为优化酵母表面展示（YSD）技术用于整合生物加工（CBP）提供了关键实验依据。

　　

Development of a FPC

研究团队创新性地构建了荧光蛋白复合物（FPC）作为人工纤维素酶体（DC）的替代模型。该复合物包含三模块支架蛋白（含CBM碳水化合物结合模块和Ac/Bc/Af来源的cohesin结构域）与GFP标记的对接蛋白（FDP），通过物种特异性cohesin-dockerin相互作用（K_D=10^?12-10^?7 M）实现自组装。支架蛋白通过Aga2p锚定在酵母表面，而FDP通过α因子信号肽分泌至胞外，为后续可视化分析奠定基础。

Population-wide analysis of FPC expression

流式细胞术定量显示：单独表达支架蛋白时64.7%细胞呈现阳性（平均13,756个/细胞），而共表达FDP时支架蛋白阳性率降至57.36%且分子数锐减61.54%。值得注意的是，仅9.19%细胞能同时表达两种组分，且生长速率降低4-7.5倍，凸显代谢负担对异源蛋白共表达的抑制作用。荧光信号连续分布特征提示分泌途径可能存在FDP滞留现象。

Single-cell analysis of FPC expression

共聚焦显微镜观察到三个关键现象：

1. 芽殖极性：自组装体系中84%阳性细胞的支架蛋白富集于新生芽体，76%案例中母细胞完全无显示，暗示细胞周期依赖性表达；

2. 分泌瓶颈：FDP在分泌途径大量累积，合成酵母联盟策略可使支架蛋白显示细胞比例恢复至56%；

3. 空间竞争：酵母联盟中支架蛋白在母细胞和单细胞中的分布更均匀，证实分担代谢压力可改善表达均衡性。

The bud tip as cellular hot spot for scaffoldin display

研究揭示了芽尖作为分泌热点的生物学机制：在trans-高尔基体分选的囊泡会沿肌动蛋白骨架定向运输至芽尖膜区。当细胞承受FDP共表达压力时，支架蛋白的分泌被限制在生长活跃区域。而在无代谢压力的单组分表达中，母细胞仍保留分泌能力，这种"母细胞自我牺牲"现象与内质网质量控制机制相关。

Conclusions

该研究通过FPC模型首次在单细胞尺度解析了酵母表面展示DC的三大瓶颈：

1. 异源蛋白共表达引发的代谢负担导致表达量级联下降；

2. 分泌途径容量限制造成蛋白滞留；

3. 细胞周期依赖性展示导致的酶组装不连续。研究提出的合成酵母联盟策略通过分布式表达将支架蛋白展示量提升5倍，为发展高效整合生物加工（CBP）系统提供了新思路。这些发现修正了当前文献中低估的DC展示异质性问题，对工程化酵母在生物质转化中的应用具有重要指导价值。