优化rpoB基因巢式PCR扩增策略提升宿主相关低浓度细菌DNA的宏条形码分析灵敏度

这篇研究通过创新的巢式PCR（nested PCR）两步扩增策略，显著提升了rpoB基因标记在低浓度细菌DNA和宿主相关微生物组（host-associated microbiota）宏条形码（metabarcoding）分析中的灵敏度。该方法克服了传统单步PCR因引物高度简并性导致的扩增效率低下问题，通过体外实验和模拟群落验证，在昆虫口腔分泌物（OS）和幼虫样本中实现了物种级分类分辨率，为宿主-微生物互作研究提供了可靠技术方案。

　　

ABSTRACT

研究针对宿主相关微生物组研究中低浓度细菌DNA的检测难题，创新性地开发了基于rpoB基因的巢式PCR扩增策略。作为细菌RNA聚合酶β亚基的编码基因，rpoB因其单拷贝特性和快速进化速率，能提供比传统16S rRNA基因更高的物种级分类分辨率。然而，其高度变异的序列特征导致引物简并性过高，在宿主DNA占主导的样本中扩增效率低下。通过设计外引物（rpoB_F/R）和内引物（Uni_rpoB_deg_F/R）的两步扩增体系，首次将巢式PCR技术应用于宏条形码分析，成功将检测灵敏度提升100倍。

INTRODUCTION

微生物组研究长期依赖16S rRNA基因的V3-V4区短读长测序，但其分类分辨率多限于属级水平。尽管PacBio全长测序能提升分辨率，但成本限制了广泛应用。相比之下，管家基因（housekeeping genes）如rpoB具有单拷贝特性，可避免16S基因多拷贝带来的定量偏差，且在伪单胞菌门（Pseudomonadota）等类群中表现出更精细的分类能力。但现有rpoB引物在宿主DNA占比超过96%的昆虫样本中几乎失效，亟需技术突破。

RESULTS

引物设计与验证

通过ClustalW比对设计的906 bp外引物和435 bp内引物，经in silico分析覆盖68%-72%的细菌多样性（47,069条rpoB序列），主要靶向伪单胞菌门和芽孢杆菌门（Bacillota）。模拟群落（Mock_8sp和Mock_8sp_log）测试显示，巢式PCR在1:100稀释度下仍可检出，而单步PCR在1:10稀释时即失效。值得注意的是，巢式PCR的Bray-Curtis差异指数（0.43±0.00）显著优于单步PCR（0.53±0.05），且未引入额外扩增偏倚。

昆虫样本应用

在草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）幼虫样本中，巢式PCR成功检出低丰度菌群（<4 μg DNA），而单步PCR完全失败。口腔分泌物（OS）中伪单胞菌门占75%，优势菌为Ochrobactrum属和Enterococcus casseliflavus；幼虫体内则检出Klebsiella quasipneumoniae和Acinetobacter soli等病原相关物种，证实该方法在复杂基质中的实用性。

DISCUSSION

该技术突破了宿主DNA干扰和低生物量样本的检测瓶颈，但其对放线菌门（Actinomycetota）和拟杆菌门（Bacteroidota）的覆盖率仍有局限。未来可通过设计门特异性引物组合进一步提升覆盖率。研究为昆虫-微生物互作、病原体检测等领域提供了高灵敏度的分子工具，尤其适用于农业害虫微生物组研究。

MATERIALS AND METHODS

样本提取采用机械裂解结合蛋白酶K消化法，测序数据经FROGS v.4.1.0流程处理。创新性地采用基因组更新工具（genome_updater）构建了包含47,069条rpoB序列的最新数据库，并通过EcoPCR v.1.0.1进行in silico引物评估。统计使用R语言Phyloseq包完成，所有代码开源于GitHub平台。