ISKNV感染罗非鱼脑细胞系的热休克保护机制研究：HSPs调控病毒凋亡基因ORF 005L的分子证据

这篇研究揭示了热休克治疗（HST）通过上调热休克蛋白（HSPs 90/47）抑制传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）复制的分子机制。通过建立罗非鱼脑（TiB）原代细胞模型，发现48小时热休克（38°C/1小时）可使HSPs表达提升4-6倍，同时病毒载量降低10倍，并显著下调病毒凋亡基因ORF 005L。该研究为加纳等地养殖户自发采用HST控制ISKNV流行提供了科学依据，为水产抗病毒策略开辟新思路。

　　

ABSTRACT

传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）是导致多种鱼类高致死性疾病的病原体，2018年传入加纳后，养殖户采用热休克处理（HST）暴露的罗非鱼苗取得一定成效。本研究通过建立尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）脑原代细胞系（TiB），在体外实验中证实：感染48小时后实施1小时38°C热休克，可使HSP90和HSP47表达分别上调4倍和6倍，同时病毒载量降低10倍。牛津纳米孔测序确认病毒主要衣壳蛋白（MCP）基因，细胞系通过COX1测序验证。值得注意的是，病毒凋亡基因ORF 005L在HSPs上调后显著抑制，提示HST可能通过调控凋亡通路抑制病毒复制。

INTRODUCTION

ISKNV属于虹彩病毒科，能引起脾肾等组织巨细胞病变，水温20-30°C时活性最强。该病毒通过小窝蛋白介导的内吞作用入侵宿主细胞，并激活自噬流促进自身复制。前期研究发现ISKNV编码的ORF 111L和ORF 005L分别调控凋亡通路，而热休克蛋白（HSPs）作为分子伴侣可抑制细胞凋亡。加纳沃尔特湖养殖户实践中发现，将病鱼短暂暴露于高温环境可降低死亡率，但机制不明。

MATERIALS AND METHODS

细胞模型建立：从50g罗非鱼脑组织分离原代细胞，经胶原酶消化后培养，其生长特性与ISKNV敏感细胞系BF-2对比显示，TiB细胞病毒载量在120小时达BF-2细胞的5倍。

热休克实验设计：设置四组——未热休克感染组（G1）、48小时热休克感染组（G2）、UV灭活病毒对照组（G3）和空白对照组（G4）。热休克程序以2°C/10-12分钟速率升温至38°C维持1小时。

检测指标：qPCR定量MCP基因计算病毒拷贝数，SYBR Green法检测HSPs 47/60/90及ORF 005L表达，采用2^?ΔΔCt方法分析差异。

RESULTS

1. 病毒复制动态：热休克组（G2）在72小时病毒载量仅增加2.5倍，显著低于未处理组（G1）的100倍增幅（P<0.0005）。

2. HSPs调控特征：HSP47和HSP90在热休克后立即呈现6倍和4倍上调（P<0.05），而HSP60变化不显著。

3. 凋亡基因互作：ORF 005L在G1组72小时显著高表达，但在G2组受抑制，与HSP90表达呈显著负相关（r=-0.82, P=0.0046）。

DISCUSSION

研究首次阐明HST通过"HSPs-ORF 005L"轴抑制ISKNV复制的分子机制：

• HSPs的双重作用：既作为应激保护蛋白稳定细胞结构，又可能竞争性结合病毒组分，阻断其利用宿主资源。

• 凋亡通路干预：ORF 005L编码的CTD样磷酸酶结构域被抑制后，病毒无法有效诱导宿主细胞凋亡，从而阻碍病毒粒子释放。

• 实践意义：解释了加纳养殖户经验性HST（通常32-35°C处理3天）的部分有效性，但提示需优化温度-时长参数以避免病毒持续感染风险。

结论

TiB细胞模型证实热休克通过HSPs/ORF 005L通路抑制ISKNV复制，为水产抗病毒管理提供理论依据。后续需开展体内实验验证HST对鱼体生长和病毒潜伏的影响，并探索HSPs与病毒蛋白的直接互作机制。