CRISPR/Cas9基因编辑的CD123/B7-H3双靶点通用型CAR-T细胞治疗急性髓系白血病的突破性研究

本文报道了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建靶向CD123/B7-H3的通用型双特异性CAR-T（UCAR-T）细胞，通过体外实验和AML小鼠模型验证其高效抗肿瘤活性。研究突破自体CAR-T（chimeric antigen receptor T cell）疗法的局限性，解决抗原逃逸难题，为急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）提供可工业化生产的“现货型”治疗方案，显著提升治疗可及性。

　　

引言

急性髓系白血病（AML）的治疗面临自体CAR-T细胞疗法制备周期长、成本高及抗原逃逸导致复发的挑战。本研究创新性地将CRISPR/Cas9基因编辑与双靶点策略结合，通过敲除T细胞受体（TCR）和β₂微球蛋白（B2M）基因构建通用型CAR-T（UCAR-T）细胞，同时靶向AML细胞表面高表达的CD123和肿瘤相关抗原B7-H3，旨在实现“即用型”治疗并克服单靶点局限性。

方法

1. 纳米抗体筛选：采用噬菌体展示技术从骆驼免疫文库中筛选出高亲和力抗CD123纳米抗体（如huNb129，K_d=8.49×10^?12 mol/L），并通过流式细胞术验证其特异性结合AML细胞系（MV4-11、THP-1）。

2. 双靶点CAR设计：将CD123纳米抗体与B7-H3单抗（hu5B1-scFv）通过柔性连接子（GGGGS）₃串联，构建两种空间构型的双特异性CAR（Tan CD123-B7-H3 CAR与Tan B7-H3-CD123 CAR）。

3. 基因编辑优化：通过电转Cas9/sgRNA复合物敲除TRAC和B2M基因（敲除效率>60%），磁珠分选获得TCR^?/B2M^? UCAR-T细胞，显著降低移植物抗宿主病（GVHD）风险。

结果

• 体外杀伤：实时细胞分析（RTCA）显示，双靶点UCAR-T对CD123⁺/B7-H3⁺ HeLa细胞的杀伤效率显著高于单靶点组（P<0.001），且对阴性细胞（Daudi/Raji）无脱靶毒性。

• 细胞因子释放：共培养实验中，双靶点组分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α水平与单靶点相当，提示未增加细胞因子风暴（CRS）风险。

• 体内疗效：在THP-1和MV4-11异种移植模型中，双靶点UCAR-T组小鼠生存期显著延长（P<0.001），且MV4-11模型显示20天后无复发，证实其持久抗肿瘤活性。

讨论

该研究首次将CD123/B7-H3双靶点策略与UCAR-T技术结合，其优势体现在：

1. 工业化潜力：单供体来源的UCAR-T可大规模生产并冻存，解决自体疗法延迟问题；

2. 协同靶向：双抗原识别降低AML细胞通过CD123或B7-H3下调逃逸的可能性；

3. 安全性：基因编辑有效规避GVHD，且细胞因子谱显示可控的免疫激活。

未来需进一步优化CAR结构域空间排列，并探索与免疫检查点抑制剂联用的协同效应。这一研究为AML及其他血液肿瘤的通用型细胞疗法开发提供了重要范式。