基于DIA质谱技术解析BRAF突变黑色素瘤耐药性中分支特异性未折叠蛋白反应的激活机制

研究人员针对黑色素瘤治疗中BRAF抑制剂耐药性问题，利用数据非依赖性采集质谱技术（DIA-MS）建立了一套解析未折叠蛋白反应（UPR）分支特异性激活的蛋白质组学方法。通过工程化细胞模型和自动化样品处理系统，鉴定出34个新的分支特异性UPR靶蛋白，并发现BRAF突变黑色素瘤细胞系在药物耐受状态下存在IRE1/XBP1s分支的差异性激活。该研究为理解肿瘤耐药机制提供了新视角，并为开发靶向UPR的治疗策略奠定基础。

　　

在肿瘤治疗领域，BRAF突变黑色素瘤对靶向药物的获得性耐药始终是临床面临的重大挑战。近年来，越来越多的证据表明，非遗传性机制在肿瘤细胞耐药表型形成中扮演关键角色。其中，内质网应激反应（ER stress）及其下游的未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）因其在维持蛋白质稳态中的核心作用而备受关注。UPR通过ATF6、IRE1/XBP1s和PERK三条分支通路协同调控细胞的生存与死亡决策，但其在肿瘤耐药性中的具体作用机制仍不明确。更棘手的是，由于UPR调控具有高度的细胞类型特异性和时空异质性，传统研究方法难以精确解析各分支通路的激活状态。

美国范德堡大学医学中心（Vanderbilt University Medical Center）化学与物理生物学项目的Lea A. Barny等研究人员在《Molecular 》发表的研究中，创新性地将工程化细胞模型与前沿质谱技术相结合，首次在蛋白质组水平系统描绘了UPR各分支通路的特异性靶标图谱。这项研究不仅为理解肿瘤耐药机制提供了新视角，更为开发靶向UPR的治疗策略奠定了方法学基础。

研究人员采用三大关键技术：1）构建可药物特异性激活单条UPR分支的HEK293^DAX和Fv2e-PERK工程细胞系；2）开发基于Biomek i5自动化平台的SP3磁珠样品处理方法；3）优化数据非依赖性采集质谱（DIA-MS）方案，相比传统TMT-DDA方法将蛋白鉴定数量提高304%。研究团队还纳入了4种BRAF-V600E突变黑色素瘤细胞系（A375、SKMEL5、SKMEL28和WM88）进行药物耐受性模型验证。

研究首先通过比较不同DIA采集方案，建立半交错式10 m/z窗口方法，使低丰度UPR蛋白检测灵敏度显著提升。在ATF6/XBP1s分支研究中，创新性地采用双维度验证策略：一方面通过TMP/DOX单独或联合处理揭示34个新分支特异性靶标，包括COPII囊泡运输相关蛋白SEC24D和TMED家族成员；另一方面结合内质网应激剂毒胡萝卜素（Tg）和衣霉素（Tm）处理验证靶标可靠性。特别值得注意的是，研究首次在蛋白质组水平证实了己糖胺生物合成途径（HBP）关键酶GFPT1和UAP1受XBP1s特异性调控。

在PERK分支研究中，通过时间分辨蛋白质组分析发现：6小时激活期主要涉及翻译抑制和染色质重塑，而18小时慢性激活阶段则显著上调氨基酸转运蛋白（如SLC1A4）和氨酰-tRNA合成酶。这种动态变化揭示了PERK通路从急性应激响应向慢性适应转变的分子特征。

将建立的UPR靶标体系应用于BRAF抑制剂（PLX4720）处理的黑色素瘤细胞后，研究发现不同细胞系呈现显著异质性：A375和SKMEL28细胞在用药8天后显示强烈的IRE1/XBP1s激活，而WM88和SKMEL5细胞则无明显反应。进一步分析表明，这种差异可能与钙信号异常导致的ER钙库耗竭有关，为理解肿瘤微环境应激响应提供了新机制。

该研究的突破性意义在于：1）创建了首个全面覆盖UPR三条分支的蛋白质组靶标体系，克服了传统Western blot只能检测个别标志物的局限；2）揭示了UPR分支激活的细胞特异性规律，为精准干预提供了分子基础；3）将钙信号异常与IRE1/XBP1s激活相关联，为理解肿瘤耐药的非遗传机制开辟了新视角。研究人员特别指出，他们的方法可推广应用于神经退行性疾病、糖尿病等其他UPR相关疾病的研究。这项发表于《Molecular 》的工作，标志着蛋白质组学在解析复杂应激响应网络方面迈出了重要一步。