新型Orbitrap Excedion Pro质谱仪通过高效EThcD技术显著提升HLA-I类免疫肽组的鉴定深度与序列覆盖度

研究人员针对HLA-I类免疫肽组分析中传统HCD/CID技术存在的序列覆盖不足和鉴定盲区问题，开发了基于新型Orbitrap Excedion Pro质谱仪的EThcD（电子转移/高能碰撞解离）方法。通过优化离子路由多极杆(IRM)中的ETD反应参数，实现了对低电荷密度免疫肽的高效碎裂，在JY、GR和Jurkat细胞系的HLA肽组分析中，EThcD使序列覆盖率提升12.5-20%，并发现31-39%的HLA-B*07:02结合肽被传统HCD遗漏。该研究为肿瘤抗原筛选和免疫治疗靶点发现提供了更全面的技术方案。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，人类白细胞抗原I类分子（HLA-I）呈递的免疫肽组（immunopeptidome）犹如细胞向免疫系统展示的"分子身份证"，其全面解析对肿瘤新抗原发现至关重要。然而现有基于碰撞诱导解离（CID/HCD）的质谱技术存在明显局限：对于含内部精氨酸（Arg）的非胰蛋白酶肽段，质子"卡"在碱性氨基酸上导致碎裂不全，造成高达4.5个氨基酸的序列缺口（sequence gap）。更棘手的是，像全球高发的HLA-A*02:01亚型肽组中，这类"难碎裂"肽占比可达37%，严重制约了肿瘤疫苗靶标的筛选精度。

荷兰乌得勒支大学（Utrecht University）生物分子质谱与蛋白质组学研究中心的研究团队在《Molecular & Cellular Proteomics》发表突破性成果。他们利用Thermo Fisher最新推出的Orbitrap Excedion Pro质谱仪，创新性地在离子路由多极杆（IRM）内实现电子转移解离（ETD），通过优化补充活化参数（SA30%）和质荷比扫描范围（350-800 m/z），将+2/+3电荷肽段的ETD反应时间缩短至13/6毫秒。研究采用弹性蛋白酶消化的HeLa细胞裂解物模拟免疫肽组特征，并选取JY（HLA-A02:01纯合）、GR（含HLA-B27:05）和Jurkat（含HLA-B*35:03）三种细胞系，系统比较了EThcD与HCD的检测效能。

关键技术包括：1）在IRM中实现快速ETD反应；2）采用FragPipe软件结合非特异性酶切数据库搜索策略；3）通过NetMHCpan 4.1算法（<1%结合阈值）进行HLA等位基因特异性肽段分配；4）双样本Logo（Two-Sample Logo）分析EThcD偏好性序列特征；5）开发Python脚本定量计算b/y与c/z离子对序列覆盖率的贡献。

研究结果揭示：

1. 新型质谱平台的性能验证

   在模拟免疫肽组的弹性蛋白酶消化物中，EThcD在SA30%参数下获得最优PSM（肽段-谱图匹配）数，较ETD-only提升49%。窄范围扫描（M1方法）即使对含15%+1电荷肽的JY肽组，仍比宽范围扫描（M2）多检出49%的肽段。

2. HCD的固有检测盲区

   公共数据集分析显示，不同HLA亚型肽组的HCD序列覆盖率差异显著：HLA-A03:01（64%）>B27:05（62%）>A02:01（52%）。特别是HLA-A02:01肽组平均存在4.5个氨基酸的序列缺口，而富含内部Arg的肽段构成主要检测盲区。

3. EThcD的互补优势

   在JY细胞中，EThcD特异性鉴定出1844条HLA-A02:01肽段（占总鉴定数37%），其序列特征为P5-P8位富集亮氨酸（Leu）；对HLA-B07:02更检出2494条独有肽段（占37%），其中82%含内部Arg。与114次公开HCD数据的对比证实，31-39%的EThcD特异性肽从未被HCD检出。

4. 序列覆盖率的质的飞跃

   EThcD使所有测试HLA亚型的序列覆盖率中位数提升12.5-20%，其中HLA-B27:05因高+3电荷比例（42%），c/z离子贡献率尤为突出。双离子系列使HLA-A02:01肽段的中位覆盖率从60%（HCD）跃升至75%。

5. 翻译后修饰解析新维度

   在Arg甲基化修饰分析中，EThcD比HCD多检出25-32%的修饰位点，88%修饰肽段结合HLA-B*07:02，且修饰Arg显著富集于P3锚定位（sub-anchor position）。

这项研究标志着免疫肽组学进入"双离子时代"——EThcD不仅填补了传统HCD的技术盲区，更通过IRM创新设计解决了ETD在低电荷肽应用中的效率瓶颈。其临床意义在于：1）为HLA-A*02:01等高频亚型提供更完整的抗原图谱；2）纠正现有预测算法的序列偏差（如内部Arg肽段的系统性遗漏）；3）为甲基化等翻译后修饰肽的免疫原性研究开辟新途径。随着Orbitrap Excedion Pro平台的推广，这项技术将加速个性化肿瘤疫苗的精准设计，并为自身免疫病、感染性疾病等领域提供更全面的抗原数据库。