高通量筛选NCp7 RNA结合活性：HIV-1药物发现的新策略

为解决HIV-1治疗中药物耐药性和靶点局限性问题，研究人员开发了一种基于AlphaScreen技术的高通量NCp7 RNA结合活性检测方法。通过药物重筛选，鉴定出7种NCp7抑制剂（如Danazol，IC50 1.19μM）和2种增强剂（如Orlistat），为靶向NCp7的广谱抗HIV药物研发提供了新工具。

　　

HIV-1感染仍是全球公共卫生的重大挑战，尽管抗逆转录病毒疗法（ART）显著降低了死亡率，但耐药性、终身服药负担和免疫功能障碍等问题亟待解决。病毒核衣壳蛋白NCp7因其在逆转录、整合和病毒组装中的关键作用，成为极具潜力的广谱靶点。然而，传统检测方法难以满足高通量药物筛选需求。

美国退伍军人事务部普吉特海湾医疗保健系统老年病学研究教育临床中心（Geriatrics Research Education and Clinical Center, Veterans Affairs Puget Sound Health Care System）的研究团队开发了一种创新的AlphaScreen检测体系，通过结合生物素标记的U3 RNA片段和GST标签的NCp7蛋白，实现了对RNA-蛋白相互作用的灵敏定量。该研究利用这一技术筛选了700种化合物，发现Danazol（IC₅₀ 1.19μM）等7种抑制剂能显著阻断NCp7与G四链体（G4）的结合，而减肥药Orlistat则意外增强其活性。相关成果发表于《SLAS Discovery》。

关键技术包括：1）优化AlphaScreen检测条件（25nM NCp7，12.5nM RNA）；2）验证已知抑制剂BRACO-19的IC₅₀（1.29μM）；3）NIH化合物库（NIHCC）筛选及剂量效应验证。

3.1 AlphaScreen原理验证

通过GST/生物素双标记系统，当NCp7结合U3 RNA时，供体/受体 beads 产生615nm信号，信噪比达9:1，耐受9% DMSO，适合高通量筛选。

3.2 已知抑制剂验证

G4结合剂BRACO-19的剂量曲线证实该方法可检测μM级抑制活性，为后续筛选奠定基础。

3.3 NIHCC筛选结果

从700种化合物中鉴定出17个显著调控NCp7活性的分子（Z值>3），其中Danazol效力超过阳性对照，而Orlistat可能解释其临床报道的病毒载量反弹现象。

3.4 剂量效应验证

7种抑制剂和2种增强剂通过11点浓度曲线确认，其中胆汁酸衍生物Ursodeoxycholic acid（IC₅₀ 2.46μM）和抗菌药Chloramphenicol（IC₅₀ 3.36μM）展现出治疗潜力。

该研究不仅建立了首个靶向NCp7 RNA结合活性的高通量平台，更揭示现有药物（如抗子宫内膜异位症药Danazol）的潜在抗HIV价值。特别值得注意的是，Orlistat对NCp7的激活效应为解释其与ART的相互作用提供了分子机制线索。未来通过优化先导化合物和探索协同用药方案，或可突破现有ART的耐药瓶颈。研究团队强调，该技术还可拓展至其他锌指蛋白-RNA互作研究领域，为RNA靶向药物开发提供通用工具。