DEER光谱技术在蛋白质建模中的应用：从自旋标记到构象景观解析

这篇综述系统阐述了双电子-电子共振（DEER）光谱结合位点定向自旋标记（SDSL）技术在蛋白质结构建模中的最新进展。文章详细分析了自旋标记（如MTSL/R1）建模方法（分子力学、旋转异构体库、粗粒化模型等），探讨了DEER数据作为实验约束的应用策略，并展示了该技术在蛋白质-蛋白质相互作用、构象变化、环区建模及从头预测等领域的成功案例，为研究蛋白质动态构象景观提供了独特视角。

　　

1. 引言

蛋白质作为生命活动的核心执行者，其结构与功能研究始终是生物物理领域的重要课题。传统高分辨率结构解析方法如X射线衍射（XRD）、核磁共振（NMR）和冷冻电镜（cryo-EM）虽已取得巨大成功，但在研究蛋白质动态特性方面存在局限。双电子-电子共振（DEER）光谱技术通过位点定向自旋标记（SDSL）可测量15-80?范围内的距离分布，为解析蛋白质构象异质性提供了独特工具。随着AlphaFold（AF）等预测方法的出现，DEER在模型验证和精细化方面展现出新的应用价值。

2. 位点定向自旋标记与DEER

典型SDSL工作流程包括：选择标记位点、突变为半胱氨酸、与自旋标记物（如MTSL）反应生成R1标记。DEER通过测量未配对电子间的磁偶极相互作用，获得时间域信号并转换为距离分布。值得注意的是，自旋标记物（如R1）的柔性连接臂导致观测到的自旋-自旋距离分布与蛋白质骨架C^α-C^α距离存在差异，这凸显了精确自旋标记建模的重要性。

3. 自旋标记模型

目前主要有四类自旋标记建模方法：

1. 分子力学模型：采用全原子力场参数化，可同步模拟蛋白质和标记物，但计算成本较高。适用于双功能标记建模，如RX和dHis-Cu(II)体系。

2. 旋转异构体集合模型：包括旋转异构体库（RL）、可及体积（AV）和偏离旋转异构体采样（ORS）方法。RL方法通过预计算旋转异构体库进行快速评估，而AV和ORS能更好避免刚体伪影，精度可达2?。

3. 粗粒化模型：如MDDS（单个氧伪原子）和RosettaDEER（集合模型），计算效率极高，特别适合大规模构象采样。

4. 经验模型：如锥形运动模型，通过统计C^β-C^β与自旋-自旋距离差异建立知识势场，速度最快但丢失分布信息。

4. DEER数据作为实验约束

4.1 标记与位点选择

标记选择需考虑环境因素（pH、还原条件等），刚性标记（如V1、R7）虽可提高分辨率但易受取向效应影响。位点筛选应避免脯氨酸、甘氨酸和埋藏位点，优先选择稳定二级结构。计算筛选工具（MMM、mtsslSuite等）可识别最能区分构象状态的位点对。

4.2 约束应用策略

DEER约束可通过三种形式整合：

• 距离统计量（均值/众数）

• 全距离分布

• 时间域信号

  其中直接使用时间域信号可避免分布反卷积引入的偏差。约束评分指标包括均方根偏差、分布重叠度、KL散度等，但最优选择仍需系统研究。

4.3 常见伪影

过度约束可能导致：

• 标记扭曲（显式模型）

• 局部骨架变形（稀疏约束）

• 间接侧链扰动

  解决方法包括引入弹性网络模型（ENM）、固定二级结构或采用片段组装策略。

4.4 集合建模

针对多模态分布，可采用：

• 最大熵方法（如BRER、EBMetaD）

• 最大简约法（线性组合拟合）

• 最大集合法（MMMx/Flex模块）

  特别适用于固有无序区域（IDRs）和细胞内测量。

5. DEER建模应用

5.1 蛋白质-蛋白质复合物

刚性对接（网格搜索、蒙特卡洛采样）已成功应用于多种体系（如[13,23,28]）。当存在结合诱导构象变化时，需结合AF预测与DEER验证。

5.2 构象变化与模型优化

通过ENM约束（MMMx）或片段组装（Rosetta）方法，DEER已解析了光/配体/pH诱导的构象变化（如[16,27,38-40]）。近期开发的DEERFold模型将AF与DEER分布整合，可预测交替构象。

5.3 环区建模

针对柔性环区和IDRs，Jeschke组开发的约束引导链延伸算法和Rosetta的集合建模方法（[153]）展现出独特优势。

5.4 从头预测

片段组装方法结合DEER约束（[6,33,45]）已实现小规模蛋白质的从头预测，精度接近实验结构。

6. 展望

随着仪器（[159]）和方法（[18,22,156]）的发展，DEER在以下方向具有巨大潜力：

1. 双功能标记的精确建模

2. 构象景观的定量解析

3. 与AF预测的深度整合

   建立标准化数据库（如[131]）将加速方法开发和基准测试。作为少数能直接测量构象分布的技术，DEER将在动态结构生物学时代发挥不可替代的作用。