单细胞转录组中长链非编码RNA检测新突破：Singletrome工具增强lncRNA鉴定与功能解析

本研究针对单细胞RNA测序(scRNA-seq)中长链非编码RNA(lncRNA)注释不足的问题，开发了Singletrome分析框架。通过整合GENCODE蛋白编码基因与LncExpDB的lncRNA注释，建立TLGA/ULGA双重过滤系统，解决了lncRNA与蛋白编码基因的正义/反义链重叠导致的计数偏差。在PBMC和肝脏单细胞数据中实现lncRNA检测量提升5倍，首次证明仅用lncRNA表达即可高精度预测细胞类型（准确率90.3%）和肝纤维化状态（AUC 93.7%），为构建人类lncRNA图谱奠定基础。

　　

在生命科学领域，长链非编码RNA（lncRNA）正成为基因调控网络的"暗物质"。这些长度超过200个核苷酸、不编码蛋白质的RNA分子，已被证明在癌症¹、免疫²和肝脏疾病³等病理过程中发挥关键作用。然而，当前单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究主要聚焦于蛋白编码基因，对lncRNA的探索严重不足。这种局限性主要源于两个技术瓶颈：现有参考注释（如GENCODE v32）仅包含16,849个lncRNA基因，远低于LncExpDB等数据库记录的100,000余个；更重要的是，lncRNA与蛋白编码基因在正义链和反义链上的广泛重叠，使得传统分析方法难以准确分配测序读数。

为突破这些限制，美国麻省总医院（Massachusetts General Hospital）的Raza Ur Rahman和Alan C Mullen团队开发了Singletrome分析平台。这项发表在《Scientific Reports》的研究通过创建三重创新解决方案：1）整合GENCODE蛋白编码基因与LncExpDB的lncRNA注释；2）开发TLGA（trimmed lncRNA genome annotation）过滤系统消除反义链重叠区域的计数干扰；3）建立5'端偏好性和单峰分布质控标准，成功将人类lncRNA检测灵敏度提升5倍以上。研究人员分析了来自外周血单核细胞（PBMC）和肝脏的26个样本、总计8.07亿条测序读数，证明新注释能检测GENCODE遗漏的数千个lncRNA，且仅用lncRNA表达谱就能实现90.3%的细胞类型分类准确率。

关键技术方法包括：1）使用Singularity容器整合GTF格式的蛋白编码基因与lncRNA注释；2）通过BEDTools分析外显子重叠区域，建立TLGA/ULGA双重注释系统；3）应用改良版RSeQC进行转录本覆盖度分析，过滤5'偏好性（>50%读数位于前10%区域）和单峰分布（单一非3'端区域读数占比>50%）的异常转录本；4）采用XGBoost机器学习模型评估lncRNA对细胞类型和疾病状态的预测能力。

【Expanding lncRNA annotations in single cell analysis】

研究团队首先系统分析了GENCODE v32与LncExpDB v2的基因组注释重叠情况。结果显示：6,309个蛋白编码基因与7,531个lncRNA存在正义链重叠，10,492个蛋白编码基因与14,212个lncRNA存在反义链重叠。通过创建TLGA注释（去除正义链重叠lncRNA，并对反义链重叠区域进行100nt缓冲修剪），最终构建包含110,599个基因（19,384个蛋白编码基因+91,215个lncRNA）的综合注释体系，使lncRNA外显子、转录本和基因的注释量分别提升4.93倍、6.46倍和5.41倍。

【Maximizing reads mapped to lncRNAs for downstream analysis】

在PBMC和两个肝脏数据集（GSE115469、GSE136103）中的对比显示，TLGA虽减少了约18.4%的lncRNA读数（PBMC中位数从174降至142），但显著提高了数据可靠性。典型案例如HSALNG0137471（与DDX3X反义重叠），TLGA仅保留非重叠区域的可靠信号，而ULGA则补充了3'端读数，为功能研究提供更完整信息。

【Quality control of lncRNA mapping】

通过改良的RSeQC分析发现，lncRNA转录本存在显著5'端富集现象（1000-3000nt转录本中前10%区域读数占比超50%），且基因长度与转录本长度的相关性（R=0.35）远低于蛋白编码基因（R=0.82）。据此建立的质控标准在PBMC数据中过滤掉433个（5'偏好性）和67个（单峰分布）低质量lncRNA基因，最终保留23,510个高置信度lncRNA。

【lncRNAs alone predict most clusters and cell types in single cell data】

仅使用lncRNA表达谱时，Singletrome注释在PBMC中产生16个细胞簇（调整兰德指数ARI=0.5），显著优于GENCODE注释的10个簇（ARI=0.3）。XGBoost模型显示，lncRNA单独预测PBMC细胞类型的准确率达90.3%，接近蛋白编码基因的96.4%。在肝脏数据中，lncRNA对肝窦内皮细胞（LSEC）等特殊亚型的区分能力尤为突出。

【Long noncoding RNAs in liver fibrosis】

在肝硬化单细胞数据分析中，研究者鉴定出937个差异表达lncRNA（padj<0.1），包括已知促纤维化因子H19和MEG3，以及GENCODE未注释的新lncRNA如HSALNG0146932（间质细胞）和HSALNG0061639（胆管细胞）。仅基于lncRNA表达的肝硬化预测模型达到93.7%准确率，证实lncRNA可作为疾病诊断的新型分子标志物。

这项研究通过创新的生物信息学框架，首次系统解决了单细胞数据中lncRNA注释与分析的三大核心挑战：注释不全、链特异性干扰和低表达噪声。Singletrome平台不仅使lncRNA检测灵敏度提升5倍，更开创性地证明lncRNA表达谱具有独立界定细胞类型和疾病状态的生物学意义。特别值得注意的是，在肝硬化研究中发现的新lncRNA如HSALNG0146932，为理解器官纤维化提供了全新分子视角。该工具的可扩展性（支持任意GTF格式注释）使其可广泛应用于不同物种研究，为构建人类细胞图谱中的lncRNA维度奠定技术基础。随着单细胞数据的持续积累，这种整合计算生物学与实验验证的研究范式，将加速揭示lncRNA在生理病理过程中的精确调控机制。