应激条件下平滑内质网形态的STEM断层扫描三维重构研究及其功能启示

这篇开创性研究采用双轴扫描透射电子显微镜(STEM)断层扫描技术，首次在纳米尺度解析了过表达多囊蛋白-2(PC-2)的HEK293S细胞中应激诱导的结晶样内质网(crystalloid-ER)和ER涡旋(whorls)的三维超微结构。研究揭示了两种内质网(ER)形态的管状/层状膜结构特征、线粒体关联膜(MAM)接触位点，以及囊泡交互网络，为理解内质网应激响应机制提供了重要结构基础。

　　

1 引言

真核细胞通过未折叠蛋白反应(UPR)应对内质网(ER)应激，导致ER膜表面积和腔室容积显著增加。研究聚焦于过表达阳离子通道蛋白多囊蛋白-2(PC-2)的HEK293S细胞，利用双轴STEM断层扫描技术突破传统透射电镜(TEM)的局限，实现了对结晶样ER和ER涡旋等有组织平滑内质网(OSER)结构的三维可视化。

2 材料与方法

采用高压冷冻-冷冻置换技术保存样品超微结构，通过800nm厚切片进行双轴STEM断层扫描。独特的"生物STEM模式"（3-4nm束斑直径）结合动态聚焦技术，在±66°高倾角下仍能保持高信噪比和对比度。使用IMOD软件进行三维重构，SeggeR算法实现自动阈值分割。

3 结果

3.1 ER涡旋与结晶样ER的二维特征

TEM观察发现PC-2过表达诱导形成两类典型结构：

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  ER涡旋：由间距一致的层状膜堆叠成直径达2μm的环形结构，边缘呈现180°极端膜弯曲

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  结晶样ER：呈现规则管状阵列，管径约160nm，六边形紧密排列

3.2 三维重构揭示细胞器互作网络

STEM断层扫描发现：

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  ER涡旋包裹数十个囊泡，观察到囊泡与终端膜的融合/出芽现象

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  线粒体互作：ER涡旋与线粒体形成典型的MAM接触位点（间距10-15nm）

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  结晶样ER与核膜通过中间囊泡建立间接联系，管状结构内部电子透明

3.3 混合形态与定量分析

约10%细胞同时存在两种ER形态：

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  空间隔离：结晶样ER（管状）与ER涡旋（层状）虽相邻但无交叉

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  膜接触位点：混合形态中发现两类ER的直接膜融合区域

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  体积优势：OSER结构占据细胞体积显著增加，单个体积可达2.2μm

4 讨论

4.1 技术创新

双轴STEM克服了传统TEM的缺失楔效应，在Z轴分辨率（约5nm）上显著优于FIB-SEM技术，首次清晰解析ER膜的纳米级弯曲特征。

4.2 功能分化证据

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  ER涡旋：边缘存在核糖体样颗粒，MAM位点提示参与脂质合成

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  结晶样ER：作为PC-2储存区，通过管间连接（约20nm窄桥）维持腔室连续性

4.3 形成机制

PC-2C端同源相互作用可能驱动膜弯曲，类似HMG-CoA还原酶诱导的结晶样ER形成。两类结构的空间分离暗示不同的分子调控机制。

4.4 生理意义

ER扩张可能是细胞存活的适应性策略：

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  增加膜面积缓解蛋白折叠压力

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  通过囊泡-线粒体网络维持钙稳态

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  特殊膜曲率可能形成特定脂质微环境

5 结论

该研究建立了应激ER三维形态学分析的金标准，揭示OSER结构是功能特化的膜域而非病理产物，为理解膜动力学与细胞应激响应提供了结构框架。