淡水生态系统中环境DNA(eDNA)与环境RNA(eRNA)的降解动态与检测能力比较研究：基于数字PCR的联网与隔离中宇宙实验

这篇研究通过数字PCR(dPCR)技术，在1000升淡水微宇宙系统中首次系统比较了环境DNA(eDNA)和环境RNA(eRNA)的降解动态。研究发现eRNA降解速率显著快于eDNA，其中信使RNA(mRNA)比核糖体RNA(rRNA)降解更快；eDNA呈现双相降解模式而eRNA为单相降解。研究证实即使在万倍稀释条件下仍能检测到eNA信号，为淡水生物监测提供了重要方法学依据。

淡水生态系统中环境核酸的降解动态与检测能力

摘要

研究采用创新的野外规模实验设计，在包含自然浮游生物群落的联网和隔离1000升中宇宙系统中，比较了四种分子标记(16S、18S、COI和LDHA)的环境DNA(eDNA)和环境RNA(eRNA)的衰减率和可检测性。实验设计通过建立生态相关且复杂的场景，评估了连通性如何影响eNA随时间的可检测性。研究使用数字PCR(dPCR)技术，首次在同一多标记框架内直接比较eDNA与eRNA的衰减，展示了即使在1:10,000稀释条件下eNA监测的强大能力。

引言

分子方法在生物监测中的应用极大地促进了生物体的检测和鉴定，特别是在正经历严重生物多样性危机的淡水群落中。基于eDNA的方法因其在水生生态系统中检测物种和种群的敏感性和准确性而受到认可。然而，eDNA在水环境中的长期持久性(从几天到几周不等)使其能够长距离运输，可能导致假阳性结果。相比之下，最近的研究表明环境RNA(eRNA)提供了更局部化和时间敏感的信号，可能更好地反映最近的生物活动。eRNA在水环境中的降解速度明显快于eDNA，持续时间约为13-240小时。

材料与方法

实验于2021年夏季在加拿大麦吉尔大学野外站的"大型实验池塘阵列"(LEAP)设施进行。每个中宇宙包含约1000升来自Hertel湖的水，该水体不含水蚤(Daphnia)。实验设计包括三个复制的网络，每个网络有四个串联连接的中宇宙(C₁-C₄)，以及三个隔离的中宇宙(I₁, I₂, I₃)。所有隔离中宇宙和每个连接网络的头部中宇宙(C₁)都添加了来自培养的水蚤(Daphnia pulex)的eNA溶液。通过一系列单向水转移建立中宇宙之间的连通性，产生系列稀释：C₁中1:10，C₂中1:100，C₃中1:1000，C₄中1:10,000。

分子分析采用数字PCR(dPCR)技术，针对四个分子标记：COI和16S(线粒体DNA标记)，18S和LDHA(核DNA标记)。其中COI和LDHA编码mRNA，16S和18S编码rRNA。所有dPCR反应均在8.5K 96孔QIAcuity纳米板上进行三重复。

结果

降解模型选择

研究发现单相模型对所有标记和eNA类型组合(除了两个核eDNA标记18S和LDHA)显示出更好的拟合。对于核eDNA标记，双相模型提供了更好的拟合，捕捉到初始快速衰减阶段和随后的慢速阶段。在隔离中宇宙中，18S eDNA和LDHA eDNA的断点分别出现在8小时和7小时。

分子间差异

eRNA在所有标记和稀释梯度中表现出比eDNA显著更高的衰减率(1.204/h-1.684/h vs. 0.013/h-0.026/h)。在隔离中宇宙中，COI-eDNA的平均衰减常数为0.018/h，而COI-eRNA为1.684/h；18S-eDNA为0.026/h，18S-eRNA为1.308/h；LDHA-eDNA为0.014/h，LDHA-eRNA为1.548/h；16S-eDNA为0.023/h，16S-eRNA为1.204/h。

标记类型差异

eRNA标记表现出明显的衰减行为差异，mRNA(COI和LDHA)比rRNA标记(16S和18S)降解显著更快。这种模式在中宇宙类型中一致，COI mRNA在隔离和连接中宇宙中都显示出比18S rRNA更快的降解。相比之下，eDNA标记的衰减率在线粒体(16S，COI)和核(18S，LDHA)标记之间没有显著差异。

检测能力

尽管稀释率很高(C₁:1:10到C₄:1:10,000)，但使用18S和COI标记在终端节点(C₄)中仍能检测到eDNA和eRNA。COI mRNA可检测24小时，而18S rRNA持续72小时(3天)。相比之下，18S和COI eDNA在连接中宇宙中直到实验结束(24天)仍可检测到。

讨论

分子差异

eRNA比eDNA降解更快的结果与先前研究一致，但值得注意的是，1000升户外中宇宙中观察到的eNA衰减率显著高于实验室测定通常报告的值。这表明户外环境的复杂性，包括更大的体积和稀释度、更多样的群落相互作用以及可变的环境条件，可能加速了eNA降解。

标记选择影响

研究采用了四种具有不同功能、基因组起源和生态相关性的分子标记。这种多标记设计同时比较mRNA与rRNA以及核与线粒体位点，为理解标记选择如何影响eNA持久性提供了全面框架。mRNA标记(COI和LDHA)比rRNA标记(16S和18S)降解显著更快，这种模式在中宇宙类型中一致。

降解模式

eRNA标记表现出统一的单相衰减，而eDNA标记根据其基因组起源显示出不同的衰减模式。线粒体标记(16S和COI)遵循单相衰减行为，而核标记(18S和LDHA)表现出双相衰减模式，其特征是初始快速阶段随后是缓慢下降。

检测意义

通过整合模拟自然水文连通性的单向流动中宇宙网络与数字PCR的高灵敏度和绝对定量，研究证实即使在极端稀释(1:10,000)条件下，所有eDNA和eRNA标记在T₀时都存在。eRNA信号比eDNA信号下降得更快，这突出了dPCR在检测低丰度eNA方面的有效性，特别是在稀释或可变的环境中。

结论

这项研究首次在野外规模的中宇宙网络中对多种分子标记的环境核酸(eDNA和eRNA)衰减率和可检测性进行了比较评估。研究发现eRNA在所有标记和生境中始终比eDNA降解更快。标记特异性衰减差异与其基因组起源和结构密切相关。重要的是，连接和隔离中宇宙之间一致的衰减率表明，在相同环境条件下，稀释和生物组成的变化都不会显著影响eNA降解。研究强调了测试多种衰减模型的重要性，因为不同的标记和分子表现出不同的降解行为。这些发现强调了分子和标记选择在eNA研究中的关键作用，这决定了生物多样性评估的时空分辨率。