大黄素通过GSK-3β介导的PD-L1蛋白降解增强肝细胞癌抗肿瘤免疫的机制研究

本研究针对肝细胞癌(HCC)免疫治疗响应率低的问题，揭示了天然化合物大黄素(emodin)通过激活糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)促进程序性死亡配体1(PD-L1)的蛋白酶体降解，显著增强CD8+T细胞抗肿瘤免疫的新机制。南方医科大学团队综合运用网络药理学、分子对接和体内外实验证实，大黄素可协同抗PD-L1抗体提高治疗效果，为HCC免疫治疗提供了新型联合策略。

　　

肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的80%-90%，全球每年约80万人因此死亡。尽管免疫检查点抑制剂(ICIs)如PD-L1抗体已用于不可切除HCC治疗，但响应率有限且副作用显著。肿瘤细胞表面PD-L1通过与T细胞PD-1结合介导免疫逃逸，其表达水平受多种翻译后调控机制影响。如何通过促进PD-L1降解增强免疫治疗效果，成为当前研究热点。

南方医科大学的研究团队发现传统中药大黄中的活性成分大黄素(emodin)具有显著抗肿瘤活性。前期研究表明其可破坏乳腺癌细胞PD-L1稳定性，但具体机制及其在HCC中的作用尚不明确。为此，研究人员通过系统实验证实：大黄素能通过靶向GSK-3β激酶促进PD-L1的泛素化降解，显著增强CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫，并与PD-L1抗体产生协同效应。相关成果发表在《Chinese Medicine》上。

研究主要采用以下关键技术：1) 建立H22细胞皮下移植瘤模型评估体内药效；2) 通过蛋白酶体/溶酶体抑制剂明确PD-L1降解途径；3) 结合网络药理学和分子动力学(MD)模拟预测靶点；4) 流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞亚群及效应分子；5) RNA测序解析免疫微环境变化；6) 生物素-链霉亲和素pull-down验证靶点互作。

Emodin抑制HCC细胞PD-L1表达

体外实验显示，25-50μM大黄素可剂量依赖性降低H22细胞PD-L1蛋白水平，且能逆转IFN-γ诱导的PD-L1上调。在H22移植瘤模型中，50mg/kg大黄素治疗显著缩小肿瘤体积(降低51.3%)，增加凋亡细胞比例，同时使PD-L1蛋白下降62.4%但不影响mRNA水平，提示其通过翻译后调控发挥作用。

增强CD8⁺T细胞抗肿瘤免疫

流式分析发现大黄素组肿瘤中CD8⁺T细胞比例升高2.1倍，NK细胞增加1.8倍。经体外刺激后，CD8⁺T细胞分泌的TNF-α、IFN-γ和颗粒酶B(Gzms-B)分别提高2.3、2.7和3.1倍，免疫组化证实肿瘤内CD8⁺T细胞浸润显著增加。

蛋白酶体途径降解PD-L1

在Huh7和LM3人HCC细胞中，大黄素同样不改变PD-L1 mRNA但加速蛋白降解。使用MG132(蛋白酶体抑制剂)可完全阻断大黄素效应，而溶酶体抑制剂CQ和自噬抑制剂3-MA无此作用。泛素化实验证实大黄素促进PD-L1多聚泛素化修饰。

GSK-3β是关键作用靶点

网络药理学筛选出GSK-3β等5个核心靶点，分子对接显示大黄素与GSK-3β结合能达-9.195 kcal/mol，MD模拟证实复合物在100ns内保持稳定。实验验证大黄素可上调GSK-3β表达，其抑制剂TDZD-8能逆转大黄素对PD-L1的降解作用，而过表达GSK-3β则增强该效应。免疫荧光显示大黄素处理后GSK-3β与PD-L1共定位增加。

协同免疫治疗应用前景

RNA测序揭示大黄素显著上调CD8α和GSK3β转录本，GSEA分析显示其富集于细胞因子-受体相互作用等免疫相关通路。联合治疗实验中，2.5mg/kg PD-L1抗体联合大黄素比5mg/kg单抗显示出更强抑瘤效果(肿瘤重量降低38.7%)，且PD-L1蛋白水平最低。

该研究首次阐明大黄素通过GSK-3β/PD-L1轴增强HCC免疫治疗的作用机制：1) 大黄素直接结合并激活GSK-3β，促使PD-L1发生磷酸化修饰；2) 磷酸化PD-L1被E3泛素连接酶识别，经蛋白酶体途径降解；3) 降低的PD-L1水平解除对CD8⁺T细胞的抑制，促进效应分子分泌；4) 与PD-L1抗体联用产生协同效应。这一发现不仅为HCC提供了新型天然药物联合治疗方案，也为克服免疫治疗耐药性提供了新思路——通过调控PD-L1降解途径而非单纯阻断其功能，可能获得更持久的抗肿瘤免疫应答。