双脉冲追踪技术揭示唾液腺发育与再生中干/祖细胞的动态变化规律

为解决唾液腺功能衰退和再生医学中的关键问题，日本新潟大学医学齿学综合研究团队通过双脉冲追踪技术（TetOP-H2B-GFP/EdU），首次系统揭示了静止态干细胞（LRCs）在唾液腺发育期定位于闰管细胞（IDCs），在组织损伤后分化为腺泡细胞（ACs）的动态过程，为干性维持和再生治疗提供新靶点。

　　

唾液腺功能障碍是衰老、放疗和自身免疫疾病（如干燥综合征）的常见后果，严重影响患者生活质量。目前人工唾液和胆碱能激动剂等疗法仅能暂时缓解症状，而干细胞疗法因缺乏对成体干细胞定位和分化潜能的认知进展缓慢。尤其令人困惑的是，唾液腺中静止态干细胞（Label-retaining cells, LRCs）是否参与组织再生，以及导管结扎损伤后腺泡细胞（Acinar cells, ACs）再生的细胞来源，始终存在学术争议。

日本新潟大学医学齿学综合研究科（Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences）的Shusuke Ohshima团队在《Regenerative Therapy》发表的研究中，创新性地将可诱导型TetOP-H2B-GFP转基因小鼠与EdU标记技术结合，通过"双脉冲追踪"策略，首次在发育和导管结扎再生模型中同步追踪了LRCs的命运。研究人员设计了三个关键实验模块：胚胎期E15至出生后P7的GFP标记联合P10-14的EdU脉冲追踪发育过程；成年期导管结扎前GFP标记与结扎释放后EdU注射的动态观察；以及长期随访至P70的细胞命运解析。

主要技术方法

研究使用TetOP-H2B-GFP转基因小鼠，通过多西环素（Dox）诱导在特定时间窗（E15-P7或成年期）标记细胞组蛋白H2B-GFP；采用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）脉冲标记增殖细胞；建立单侧唾液腺导管结扎-释放模型模拟组织损伤修复；通过免疫荧光共定位SOX2、αSMA、Ki67等标志物解析细胞特性；使用365×365 μm²网格系统定量标记细胞分布。

研究结果

3.1 H2B-GFP发育动态

胚胎期E15标记显示，GFP⁺ LRCs在出生后P0主要滞留于纹状导管细胞（Striated duct cells, SDCs），其荧光强度显著高于闰管细胞（Intercalated duct cells, IDCs）。至P30时，增殖标志物Ki67表达从全腺体广泛分布转为IDCs特异性富集，提示IDCs是发育后期的关键增殖区。

3.2 双标记发育追踪

出生后P10-14的EdU脉冲显示，GFP⁺EdU⁺细胞主要定位于IDCs、肌上皮细胞（Myoepithelial cells, MECs）和ACs。值得注意的是，第3周时SDCs与IDCs的标记呈现互补模式——SDCs保留GFP而IDCs摄取EdU，暗示IDCs通过不对称分裂参与组织构建。

3.3 导管结扎再生模型

结扎后3天，Ki67⁺细胞在导管和MECs中出现双峰式增殖高峰；1周后ACs开始再生。关键发现是：GFP⁺EdU⁺细胞在再生早期（1周）仅见于IDCs和MECs，但随着修复进程（2-8周），逐渐出现双标记ACs，证实静止态干细胞可分化为功能细胞。

3.4 长期再生追踪

当GFP标记持续至出生后1周时，损伤后的EdU⁺细胞优先定位于MECs和IDCs，且与GFP⁺LRCs共定位，而对照组未见此现象。免疫组化证实SOX2⁺干细胞特征始终保留在导管和MECs中。

讨论与意义

该研究通过精密的时序标记技术，揭示了唾液腺中两种不同的干细胞行为模式：在发育阶段，IDCs作为主要干细胞巢维持组织构建；而在损伤修复时，IDCs和MECs中的LRCs突破谱系限制，转分化为ACs。这一发现解决了关于"导管干细胞是否参与ACs再生"的长期争议，并为临床干预提供了新思路——靶向激活IDCs/MECs中的静止态干细胞可能是恢复唾液分泌的有效策略。

研究还提出了损伤严重程度决定干细胞应答模式的新假说：在导管结扎等重度损伤下，IDCs和MECs表现出可塑性；而辐射等轻度损伤可能仅激活导管干细胞自我更新。这种分级响应机制为个性化再生治疗提供了理论框架。技术层面，双脉冲追踪范式为研究其他器官的干细胞动力学提供了可借鉴的方法学模板。