单细胞空间转录组学揭示Wnt信号调控细胞外基质发育在腭裂模型中的关键作用

本研究通过单细胞空间转录组学技术首次解析了Pax9-/-腭裂模型中Wnt信号通路与细胞外基质(ECM)发育的时空关联。研究人员采用Visium HD和Xenium In Situ等前沿技术，发现Pax9缺失导致Alx1、Prrx1等同源盒基因及Col1a1、Eln等ECM成分表达异常，为腭裂发病机制提供了新的分子见解。该成果发表于《Scientific Reports》，为腭裂治疗靶点开发奠定基础。

　　

颅面发育是胚胎时期最精密的生物学过程之一，其中腭部形成涉及复杂的分子调控网络。尽管已知PAX9基因突变与人类腭裂相关，但该转录因子如何调控腭部微环境中的信号传导和细胞外基质组装，仍是未解之谜。美国国立卫生研究院国家儿童健康与人类发展研究所（National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development）的Jeremie Oliver Pi?a团队在《Scientific Reports》发表的研究，首次应用单细胞空间转录组学技术揭示了这一关键科学问题。

研究人员选择Pax9^-/-小鼠作为模型，该模型表现出完全外显的腭裂表型。通过整合Visium HD全转录组空间测序（分辨率达2×2 μm）、Xenium In Situ多重mRNA定位（350个定制基因 panel）和RNAscope多重荧光原位杂交三项前沿技术，系统分析了胚胎12.5天（E12.5）和13.5天（E13.5）的腭部发育动态。样本来自同窝出生的野生型和基因敲除小鼠，确保发育阶段可比性。

全转录组单细胞空间测序揭示Wnt信号和胶原组织紊乱

研究首先通过伪批量分析显示野生型与突变型样本的转录组差异。功能富集分析发现，Pax9缺失导致E12.5腭部出现自噬、突触组装、Wnt/Fgf信号负调控等通路异常，而E13.5时胶原纤维组织、Bmp信号和肌细胞增殖等过程显著改变。空间表达图谱显示，Wnt激动剂Sfrp2和胶原蛋白Col1a1在Pax9^-/-腭架内侧区域早期（E12.5）即出现下调。

高多重空间转录组分析建立新型计算流程

为验证上述发现，研究开发了定制分析流程：利用Shh/Ptch1共表达精确定位腭架口腔-鼻腔轴，划分6400 μm²标准区域进行差异表达分析。E12.5至E13.5的发育过程中，野生型腭架显示Col1a1、Eln等ECM基因和Prrx1、Alx1等模式形成基因上调，而Pax9^-/-模型该趋势显著减弱。特别值得注意的是，口腔域中Dkk1（Wnt抑制剂）异常上调，同时Rspo1、Jag1等Wnt调节因子下调。

Pax9^-/-模型显示时空基因程序紊乱

亚区域分析揭示，突变型腭架在四个关键基因类别出现表达异常：(1)同源盒基因（Alx1、Prrx1、Msx1）；(2)Wnt调节因子（Dkk1、Rspo1、Wif1）；(3)Wnt效应分子（Wnt5a、Wnt16）；(4)ECM蛋白（Lum、Ogn、Col1a1等）。E13.5时，鼻域中Wnt5a、Tnn显著下调，而Wnt16异常上调，显示Pax9缺失导致Wnt通路时空调控失衡。

Xenium原位定位验证关键靶点

空间密度图直观显示，Pax9^-/-腭架中Alx1、Prrx1等转录因子在生长前沿表达缺失，Wnt拮抗剂Wif1分布紊乱，ECM组分Lum、Ogn的沉积模式异常。这些发现与H&E染色显示的腭架延伸缺陷表型高度一致，提示Pax9通过协调模式形成与ECM重塑指导腭部形态发生。

该研究首次在单细胞分辨率绘制了腭部发育的空间转录图谱，阐明Pax9通过双重调控Wnt信号效应和ECM组织指导腭架形态发生的分子机制。发现Pax9缺失导致：(1)同源盒基因空间表达程序紊乱；(2)Wnt激动剂/拮抗剂平衡破坏；(3)胶原蛋白网络组装缺陷。这些发现为理解非综合征性腭裂的发病机制提供了新视角，特别是指出ECM结构异常可能是腭架无法完成垂直延伸和融合的关键因素。研究所建立的空间多组学分析框架，也为其他器官发育研究提供了方法论参考。未来针对Wnt-ECM轴的治疗策略，或可成为腭裂预防和再生医学的新方向。