利用毕赤酵母源重组白蛋白实现无血清培养肉生产的技术突破

本研究针对培养肉生产中胎牛血清(FBS)成本高、标准化难及伦理问题，开发了毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的重组牛白蛋白(Br-A)和猪白蛋白(Pr-A)作为血清替代物。通过短期/长期培养实验证实，3,200 μg/mL Br-A能显著促进牛肌肉卫星细胞(bMuSCs)增殖并维持Pax7表达，660 μg/mL Br-A使肌管分化效率提升3.4倍。该技术为培养肉工业化提供了经济高效的无血清解决方案，相关成果发表于《iScience》。

　　

随着全球肉类需求增长与传统畜牧业环境负担加剧，培养肉技术被视为可持续蛋白质来源的重要突破口。然而，当前培养肉生产严重依赖胎牛血清(FBS)，不仅导致成本居高不下（占生产成本的80%以上），还存在批次差异大、潜在病原体风险和动物伦理争议等痛点。更棘手的是，现有的人源重组白蛋白(Hr-A)虽能部分替代FBS，但将人类蛋白质引入食品链可能引发消费者心理抵触。这一系列挑战严重制约着培养肉技术的产业化进程。

针对这一技术瓶颈，韩国全北国立大学(Jeonbuk National University)动物科学系Hyun Woo Choi团队联合酵母生物技术公司YEASTECHBIO开展了一项创新研究。研究人员另辟蹊径，选择食品级微生物——毕赤酵母(Pichia pastoris)作为表达宿主，成功制备出重组牛白蛋白(Br-A)和猪白蛋白(Pr-A)，系统评估了其对牛肌肉卫星细胞(bMuSCs)增殖分化的影响，相关成果发表在交叉学科期刊《iScience》上。

研究团队主要采用三大关键技术：首先通过密码子优化构建pPICZaA表达载体，在5L生物反应器中实现Br-A(14.8 mg/mL)和Pr-A(13.3 mg/mL)的高效分泌表达；其次建立从韩国本土牛肌肉组织分离bMuSCs的原代培养体系；最后结合MTT检测、流式细胞术和qRT-PCR等多维度评估手段，系统分析不同浓度重组白蛋白对细胞增殖、干细胞标志物(Pax7/MyoD1)表达及肌管分化(MyHC)的影响。

重组白蛋白的酵母表达系统

通过XbaI/XhoI酶切将优化后的BSA/PSA基因克隆至pPICZaA载体，经电转化获得毕赤酵母X33工程菌株。采用两阶段发酵策略：先以甘油为碳源使菌体密度达到OD₆₀₀=180，再切换甲醇诱导表达。SDS-PAGE显示纯化的rBSA/rPSA分子量均为66 kDa，与商业BSA一致（图1B）。

短期培养效果评估

在3天短期培养中，3,200 μg/mL Br-A处理组的细胞活力显著优于对照组（图2B），第4天细胞数量达21.6×10⁴，接近Hr-A效果（25.2×10⁴）。值得注意的是，Br-A显著上调干细胞标志物Pax7表达2.1倍，同时维持了肌管分化能力（图2F）。相比之下，Pr-A虽在800 μg/mL时促进增殖，但高浓度(6,400 μg/mL)出现细胞毒性。

长期培养稳定性

28天7代传代实验显示，800 μg/mL Br-A能维持稳定的群体倍增水平（CPDL=12.5），与Hr-A相当（图3C）。qPCR证实该浓度下Pax7表达保持最高，而3,200 μg/mL Pr-A则导致Pax7/MyoD1表达下调（图3D），提示物种匹配性对长期培养至关重要。

无血清分化方案突破

在分化阶段，660 μg/mL Br-A（相当于3% FBS浓度）使早期肌生成标志物MyoG表达提升3.4倍，220 μg/mL Br-A使肌球蛋白重链(MyHC)表达增加1.9倍（图4C）。免疫荧光显示Br-A处理组形成多核肌管的能力与FBS组相当（图4B），首次证明微生物源白蛋白可完全替代血清支持终末分化。

这项研究通过微生物发酵技术成功破解了培养肉产业的"血清依赖"困局。毕赤酵母表达的Br-A不仅将白蛋白生产成本降低至传统FBS的25%，其物种匹配性还规避了Hr-A的伦理争议。特别值得注意的是，3,200 μg/mL Br-A在维持bMuSCs干性方面展现出超越Hr-A的潜力，而仅需220-660 μg/mL即可实现高效肌管分化，这为建立标准化无血清培养体系提供了关键参数。尽管Pr-A效果稍逊，但研究证实微生物表达系统具备生产不同物种白蛋白的灵活性，未来可通过优化翻译后修饰进一步提升效能。该技术路线兼具经济性（酵母高密度发酵）、安全性（食品级宿主）和可扩展性，为培养肉工业化生产扫清了关键障碍。