酿酒酵母安全生物系统设计：建立有效的生物封闭策略及逃逸机制解析

这篇研究通过开发基于樟脑调控的RelE毒素开关系统（CamOff-RelE），在实验室和工业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中建立了高效生物封闭策略，揭示了逃逸突变的多重机制。研究证明二倍体菌株通过增加基因拷贝数可将逃逸频率降至10?6，同时保持生物催化活性，为基因工程微生物（GMMs）的安全应用提供了关键设计原则。

　　

引言

随着生物经济的快速发展，基因工程微生物（GMMs）在工业生产和环境修复中的应用日益广泛。然而，如何确保这些微生物在自然环境中的安全性成为关键挑战。本研究聚焦酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），通过设计基于樟脑调控的RelE毒素开关系统（CamOff-RelE），系统评估了生物封闭效率及逃逸机制，为安全生物系统设计提供了新见解。

结果

樟脑调控系统在实验室和工业酵母中均有效

CamOff开关源自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的樟脑氧化操纵子，通过改造后可在酵母中实现基因表达的精准调控。实验表明，该系统在实验室菌株（BY系列）和工业菌株（PE-2）中均能有效控制绿色荧光蛋白（GFP）的表达，且在樟脑存在时完全抑制毒素RelE的活性。值得注意的是，工业菌株PE-2因缺乏实验室菌株的营养缺陷型标记（auxotrophies），显示出更高的逃逸频率（3.6×10^?5 vs. 8.33×10^?6）。

二倍体菌株展现优越封闭性能

通过CRISPR技术将CamOff-RelE系统整合至二倍体酵母基因组中，发现含有两个同源拷贝的菌株逃逸频率显著降低。例如，BY二倍体菌株的逃逸率低至10^?6，且乙醇产量未受影响。相比之下，单倍体菌株因基因组冗余度低，逃逸率接近100%。

逃逸机制的多重性

全基因组测序（WGS）揭示了逃逸事件的复杂机制：

1. 靶标突变：约57%的逃逸株在cam-TA或RelE基因中积累突变，如cam-TA的DNA结合域关键位点G33C突变导致调控失效。

2. 基因组适应性：其余逃逸株通过改变DNA修复（如CDC14磷酸酶突变）或细胞壁合成（如MNN4缺失）等通路间接逃逸。

3. 工业菌株特异性：PE-2因异宗配合（heterothallism）特性，更易通过基因转换（gene conversion）逃逸。

讨论

研究强调了二倍体基因组在生物封闭中的核心作用，并提出未来方向：

• 抗逃逸设计：通过引入RelB抗毒素或优化启动子（如TDH3pr）减少系统泄漏。

• 环境验证：需在模拟自然环境（如陆地微宇宙系统）中测试封闭效能。

• 工业适配性：PE-2菌株的乙醇产量未受封闭系统影响，证实了其在规模化生产中的潜力。

材料与方法

实验采用CRISPR-Easyclone标记游离系统构建菌株，通过液相色谱（HPLC）量化乙醇，并利用Illumina短读长测序解析突变谱。突变率通过刀豆氨酸抗性（CAN1）实验评估，证实CamOff系统未显著增加基因组不稳定性。

结论

本研究为酿酒酵母生物封闭提供了可推广的设计框架，揭示了逃逸的遗传基础，并证明工业菌株中多拷贝整合策略的可行性，为GMMs的安全部署奠定了理论基础。