抗ADA2单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的构建及其在胸膜结核诊断中的应用价值

本研究通过噬菌体展示技术成功构建抗ADA2单链抗体-碱性磷酸酶（scFv-AP）融合蛋白，开发出高特异性夹心ELISA检测法。该技术实现了胸膜液中ADA2浓度的精准定量（检测限1 ng/mL），在41例结核性（TB）与47例非结核性胸膜积液对比中，ADA2检测展现出98%灵敏度与91%特异性（cutoff值300 ng/mL），其诊断效能显著优于传统总ADA活性检测（76%特异性）。该研究为胸膜结核提供了标准化诊断工具，并拓展了ADA2在HIV、肿瘤等疾病中的监测潜力。

　　

Introduction

腺苷脱氨酶（ADAs）通过催化腺苷水解为肌苷调控免疫反应，其中ADA2作为溶酶体蛋白可激活浆细胞样树突细胞与巨噬细胞。结核分枝杆菌感染时，胸膜液中ADA2活性显著升高（主要源自感染巨噬细胞分泌），但传统总ADA检测受pH值、底物浓度及ADA1干扰（红细胞裂解易致假阳性），亟需特异性定量方法。

Materials and methods

研究团队从合成人源scFv文库（scFvP+scFvM，库容1.6×10¹⁰）中，通过三轮磁珠ADA2抗原筛选（结合条件：50 mM Tris-PBS pH 7.0含1% BSA），获得15个高亲和力克隆。最优scFv基因经pAK600H载体表达为AP融合蛋白，镍柱纯化后Kd<10 nM。检测体系采用兔多抗包被捕获ADA2，scFv-AP结合后通过pNPP显色（405 nm读数）。临床验证纳入88例胸膜液样本（41例TB，47例非TB），对比总ADA（Roche比色法）与ADA2检测效能。

Results

1. 1.

   分子构建：scFv-AP含pelB信号肽、VL/VH结构域（抗原识别位点SYSMH/SIWGVNGETD）及6×His标签（图1），稳定性达5年以上。

2. 2.

   诊断性能：TB组ADA2中位数达580 ng/mL，显著高于非TB组（UPPE/CPPE/恶性肿瘤中位数<120 ng/mL）。ROC曲线显示ADA2的AUC为0.992，优于总ADA的0.955（图5）。

3. 3.

   关键阈值：300 ng/mL cutoff值时，阴性似然比0.03可有效排除TB；而4例假阳性总ADA病例中，仅1例CPPE出现ADA2升高（表3）。

4. 4.

   特殊发现：淋巴瘤胸膜液ADA2水平异常升高（中位数300 ng/mL），提示鉴别诊断需谨慎（表5）。

Discussion

该研究突破传统酶活性检测局限，首次实现ADA2绝对浓度测量。其核心优势在于：

• •

  规避pH/底物依赖性，使跨中心数据可比；

• •

  特异性识别ADA2，避免ADA1干扰（如红细胞污染）；

• •

  300 ng/mL阈值与经典35 U/L总ADA活性等效，便于临床转化。

  未来可探索LDH/ADA2比值对复杂病例的鉴别价值，并拓展至DADA2综合征、HIV合并感染等场景。局限性包括单中心回顾性设计，需多中心前瞻性验证。

（注：全文数据均来自原文图表，未添加主观推断）