基于拓扑支架的三特异性重组蛋白-药物偶联物实现实体瘤的完全根除及其空间位效机制研究

（编辑推荐）本研究创新性地利用SpyTag-SpyCatcher技术构建星形拓扑结构的三特异性重组蛋白(sRP-EHI)，通过同时靶向EGFR、HER2和整合素αvβ3，显著提升SN38药物递送效率。相比线性结构(RPDC)，星形结构展现出更强的细胞摄取、受体阻断和肿瘤蓄积能力，在小鼠模型中实现小肿瘤完全根除和大肿瘤显著抑制，为多靶点ADC设计提供了拓扑工程新范式。

　　

引言

肿瘤治疗领域迎来革命性突破——通过精确控制蛋白质拓扑结构实现多靶点协同治疗。传统抗体-药物偶联物(ADC)受限于单靶点识别和肿瘤异质性，而本研究利用基因工程融合与SpyTag-SpyCatcher技术，首次构建具有星形和线性拓扑的异源三聚体重组蛋白，可同时结合癌细胞表面的EGFR、HER2和整合素α_vβ₃。这种创新设计不仅解决了多靶点ADC的构建难题，更揭示了"空间位效"对生物活性的决定性影响。

重组蛋白制备

研究团队设计了两大模块：含EGFR纳米抗体和RGD环肽的RP-ETI（26.3 kDa），以及含HER2纳米抗体的RP-HSC（24.3 kDa）。通过SpyCatcher/SpyTag生物正交反应，成功组装出星形三特异性蛋白sRP-EHI（50.5 kDa）。AlphaFold 3结构模拟显示，星形拓扑使所有靶向域位于分子末端，而线性结构lRP-EHI和lRP-HEI的中段靶向域则存在空间位阻。生物层干涉实验证实，sRP-EHI对EGFR、HER2和整合素α_vβ₃的解离常数(K_D)分别达7.77 nM、6.99 nM和1.19 nM，显著优于线性变体。

药物偶联与表征

选择拓扑异构酶I抑制剂SN38作为载荷，通过PEG2000连接臂引入马来酰亚胺端基，与蛋白质巯基点击化学反应构建偶联物。星形sRPDC-EHI展现出3.1的药物抗体比(DAR)，优于线性变体（1.29-1.72）。动态光散射证实其在PBS中72小时保持稳定，紫外特征峰368 nm验证了偶联成功。

生物学优势机制

在HeLa、MCF-7和A549细胞中，星形结构的细胞摄取强度达线性结构的1.37-5.52倍。共聚焦显微镜显示其通过ATP依赖、网格蛋白、小窝蛋白和巨胞饮四重途径内化，而线性结构仅激活前两种。流式细胞术证实sRP-EHI对EGFR、HER2和整合素α_vβ₃的阻断率最高达56%、30%和35%。Western blotting显示其受体下调效果超线性结构1.2-1.8倍，且无细胞毒性。

卓越的抗肿瘤效果

在50-100 mm³的HeLa移植瘤模型中，0.4 mg/kg剂量的sRPDC-EHI六次给药实现肿瘤完全消退，而线性变体仅抑制52-73%。对于>100 mm³的大肿瘤，0.8 mg/kg剂量使sRPDC-EHI组肿瘤体积缩减87%，显著优于线性组的17%。近红外成像揭示其独特的长循环特性——给药100小时后肿瘤蓄积量反增1.7倍，肝脏代谢仅剩70%。

结论与展望

该研究开创性地证明蛋白质拓扑结构决定多靶点药物的"空间位效"，星形设计使三特异性ADC突破实体瘤治疗瓶颈。未来通过开发双载荷系统或联合免疫治疗，有望进一步克服大肿瘤耐药性。这种模块化平台可通过替换靶向域或载荷，为精准肿瘤学提供通用解决方案。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持内容；专业术语均保留原文英文缩写及格式；所有实验细节如分子量、抑制率等参数均与原文一致）