缺氧应激下线粒体DNA通过细胞外囊泡介导的细胞间通讯驱动肝细胞癌进展的机制研究

这篇研究揭示了缺氧条件下肝细胞癌（HCC）细胞通过细胞外囊泡（EVs）释放线粒体DNA（mtDNA），激活巨噬细胞cGAS/STING/NF-κB通路，诱导M2型极化并形成免疫抑制微环境的关键机制。研究创新性提出线粒体质量控制（MQC）信号介导mtDNA释放的时空动态特征，并通过纳米递送系统（HA@PLGA-Mdivi-1）靶向干预该过程，为改善HCC免疫治疗敏感性提供了新策略。

　　

ABSTRACT

免疫治疗为肝细胞癌（HCC）提供了新机遇，但免疫抑制微环境限制了其疗效。研究发现缺氧条件下肿瘤细胞通过异常线粒体DNA（mtDNA）应激作为细胞间通讯信号，经细胞外囊泡（EVs）传递至巨噬细胞，激活cGAS/STING/NF-κB通路并诱导M2型极化。体外和体内实验证实，缺氧通过增强线粒体质量控制（MQC）信号促进mtDNA释放，随后通过EVs外泌至巨噬细胞。纳米递送系统修饰的药物可靶向抑制肿瘤生长，为HCC治疗提供新方案。

Graphical Abstract

缺氧应激下HCC细胞释放的EVs携带mtDNA，协调肿瘤细胞与免疫细胞间通讯，通过激活cGAS/STING/NF-κB信号促进巨噬细胞极化，形成促HCC恶性进展的免疫抑制微环境。

1 Introduction

HCC作为高致死性肝癌，其免疫抑制微环境是免疫治疗的主要障碍。缺氧作为关键驱动因素，通过诱导肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）极化影响肿瘤-免疫细胞互作。线粒体作为氧感受器，其DNA（mtDNA）可被识别为损伤相关分子模式（DAMP），激活先天免疫信号。EVs作为细胞间通讯载体，在缺氧条件下内容物显著富集，但其介导mtDNA传递的机制尚未阐明。

2 Materials and Methods

2.1 EV分离与鉴定

缺氧培养HCC细胞（SNU-387/SNU-449/Hepa1-6）48小时后，通过超速离心法分离EVs，透射电镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）确认其形态和粒径（约100-200 nm）。Western blot检测外泌体标志蛋白CD9/CD63/TSG101。

2.2 动物实验

C57BL/6J小鼠皮下接种Hepa1-6细胞建立肿瘤模型，通过流式细胞术分析肿瘤组织CD11b⁺CD163⁺/CD206⁺ M2型巨噬细胞浸润。

2.3 纳米颗粒制备

采用透明质酸（HA）修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）负载线粒体分裂抑制剂Mdivi-1，构建靶向纳米颗粒HA@PLGA-Mdivi-1，表征显示其粒径159.7±48.1 nm，pH 5.0环境下释放效率更高。

3 Results

3.1 缺氧EVs促进巨噬细胞M2极化

TCGA数据分析显示高缺氧组HCC患者生存期最短且M2巨噬细胞浸润增加。缺氧EVs处理THP-1细胞后，M2标志物（Arg1/CD206/CCL18）表达上调，TGF-β分泌增加，而M1标志物无显著变化。

3.2 EVs-mtDNA通过cGAS/STING/NF-κB通路激活

DNase I+Triton X-100处理可特异性清除EVs内mtDNA，导致M2极化减弱。机制上，mtDNA激活巨噬细胞STING，促进IκB/NF-κB磷酸化和IL-6分泌，该效应可被STING抑制剂H-151阻断。

3.3 缺氧通过MQC信号促进mtDNA释放

缺氧初期（12小时）mtDNA在HCC细胞质内累积，24小时后通过瞬时开放线粒体通透性转换孔（mPTP）释放。MQC关键蛋白DRP1（线粒体分裂）、BNIP3（线粒体自噬）表达上调，该过程可被Mdivi-1抑制。

3.4 纳米靶向治疗抑制肿瘤进展

体内实验显示，HA@PLGA-Mdivi-1通过减少EVs-mtDNA释放，显著抑制原发灶和远端肿瘤生长（体积减少60%），并降低M2巨噬细胞浸润。荧光成像证实纳米颗粒在肿瘤组织特异性富集。

4 Discussion

研究首次阐明缺氧-HCC细胞通过MQC动态调控mtDNA释放，经EVs递送至巨噬细胞激活非经典STING/NF-κB通路的新机制。区别于传统认知，肿瘤细胞自身STING信号沉默，而巨噬细胞STING激活反而促进免疫抑制。靶向线粒体的纳米策略为逆转HCC免疫耐受提供了转化潜力。

Author Contributions

傅佳颖等通过多组学实验验证了mtDNA-EVs的生物学功能，苏静团队设计纳米递送系统并完成机制研究。所有动物实验均通过吉林大学动物伦理委员会审批（202267号）。