工程化改造Pseudomonas taiwanensis代谢1,4-丁二醇和己二酸路径实现塑料单体升级转化为芳香化合物

这篇研究论文创新性地通过适应性实验室进化（ALE）和反向遗传学改造，成功扩展了芳香化合物高产菌株Pseudomonas taiwanensis对聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）降解单体1,4-丁二醇（BDO）和己二酸（AA）的代谢能力。研究揭示了核糖体蛋白编码基因rpmE突变在生长速率与芳香产物合成间的权衡关系，并鉴定出关键脱氢酶PVLB_10545在BDO代谢中的替代作用。通过整合RpcTAL基因，实现了从塑料单体到4-香豆酸（14.4% Cmol/Cmol产率）的高效生物升级回收，为混合塑料废弃物的闭环处理提供了新策略。

　　

工程化改造Pseudomonas taiwanensis代谢路径实现塑料单体升级转化

引言

塑料危机已成为现代社会面临的重大挑战，全球每年产生约3.6亿吨塑料废弃物中仅9%被回收利用。聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）作为可生物降解的脂肪族-芳香族共聚酯，其完全循环利用需要开发针对混合塑料废弃物的解决方案。本研究选择Pseudomonas taiwanensis VLB120作为宿主，该菌株具有优异的溶剂耐受性，其基因组精简的酪氨酸高产菌株GRC3Δ5-TYR2已被证明是芳香化合物合成的理想平台。

建立AA和BDO代谢途径

通过适应性实验室进化（ALE）结合基因组测序，研究人员首先在携带dcaAKIJP基因簇（来自Acinetobacter baylyi）的工程菌株中建立了AA代谢能力。六组平行进化实验显示，所有获得AA代谢能力的菌株均出现paaXY基因区突变，这与P. putida KT2440中苯乙酸降解途径的激活机制相似。反向工程实验证实，删除paaYX阻遏基因即可实现AA代谢，但生长速率（0.05 h^-1）显著低于进化菌株（0.15 h^-1）。

值得注意的是，与P. putida不同，删除β-氧化调节基因psrA对P. taiwanensis的AA代谢没有显著促进作用。全基因组测序发现所有进化菌株均在核糖体蛋白编码基因rpmE区域存在突变，包括402 bp缺失、单核苷酸变异（SNV）以及启动子区突变。实验证明这些突变通过改变bL31蛋白结构或表达水平，在生长速率与芳香化合物产量间形成权衡——突变菌株生长更快但酪氨酸产量降低约50%。

BDO代谢的关键酶鉴定

针对BDO代谢的进化实验揭示了PVLB_10545脱氢酶的关键作用。该酶可替代P. putida中特有的PedE脱氢酶，催化BDO初始氧化为4-羟基丁醛。通过反向工程构建的包含PVLB_10540^L480L（沉默突变）、PVLB_12690^A247V（LysR家族转录调节因子）和PVLB_13305^S141P（σ因子依赖调节因子）三重突变的工程菌株，实现了与最佳进化菌株相当的生长速率（0.114 h^-1）。

代谢途径分析表明，BDO可能通过两条并行路径代谢：1）经4-羟基丁酸、琥珀酸半醛最终进入TCA循环；2）通过CoA活化后经β-氧化生成乙酰-CoA和乙醇酰-CoA。有趣的是，在AA和BDO混合培养中，工程菌株表现出底物偏好性，而混合培养则可实现两种单体同步完全消耗。

4-香豆酸的高效生产

为实现塑料单体的升级转化，研究人员将来自Rivularia sp. PCC 7116的酪氨酸特异性氨裂解酶RpcTAL（活性1.45 U/mg）整合至工程菌株。为避免强表达带来的代谢负担，采用水杨酸诱导型nagR/P_nagAa启动子系统控制基因表达。优化后的生产菌株在BDO和AA上分别实现14.4%±0.1%和11.5%±0.3%的4-香豆酸碳摩尔产率，且完全避免了trans-肉桂酸副产物的积累。

结论与展望

本研究成功构建了能将PBAT主要单体转化为高值芳香化合物的P. taiwanensis工程菌株，揭示了不同Pseudomonas菌株间代谢调控的显著差异。特别重要的是发现了rpmE突变在代谢工程中生长与生产权衡的新机制。未来可通过引入其他单体代谢途径（如对苯二甲酸降解）进一步扩展该平台的底物谱，为建立真正的混合塑料生物精炼厂奠定基础。