PAX6依赖的人iPSC来源眼表发育类器官单细胞转录组揭示眼表上皮分化图谱

本研究通过单细胞RNA测序技术解析了人诱导多能干细胞(hiPSC)来源的眼表发育类器官(SEAM)中PAX6依赖的分化轨迹，揭示了角膜、缘膜和结膜上皮的发育起源，发现结膜谱系细胞贡献于缘膜上皮群体，并证实PAX6活性梯度调控眼表上皮的谱系特异性分化，为理解人类眼表早期发育提供了新见解。

　　

眼睛作为人体最精密的感官器官之一，其表面覆盖的多层上皮组织构成了抵御外界伤害的第一道屏障。角膜、缘膜和结膜上皮共同构成眼表功能单元，这些细胞均起源于表面外胚层(SE)，但长期以来关于缘膜上皮的胚胎起源以及PAX6转录因子如何调控不同谱系分化的机制仍存在诸多未解之谜。传统研究依赖动物模型和人类胎儿组织，难以精确捕捉早期发育事件，而诱导多能干细胞(hiPSC)技术的突破为在体外模拟人类眼表发育提供了全新途径。

日本大阪大学的研究团队在《Communications Biology》发表的研究中，利用双报告基因标记的hiPSC构建了自形成外胚层自主多区(SEAM)类器官模型，通过单细胞转录组测序(scRNA-seq)技术绘制了从表面外胚层到角膜、缘膜和结膜上皮的发育图谱。研究发现结膜谱系细胞在谱系分叉前即表达缘膜上皮标志物，证实缘膜上皮群体部分来源于结膜谱系；更重要的是，PAX6的活性和表达水平呈现角膜上皮>缘膜上皮>结膜上皮的梯度分布，提示眼表上皮的谱系特异性分化受PAX6剂量调控。

关键技术方法包括：1)构建PAX6-EGFP/TP63-tdTomato双报告hiPSC系；2)分时段(2/4/8周)荧光激活细胞分选(FACS)获取TP63阳性细胞；3)单细胞转录组测序与人类胎儿眼表数据整合分析；4)SCENIC算法解析转录调控网络；5)基于PAX6表达梯度分选构建功能化上皮细胞片。

SE分化及2周发育期的PAX6相关转录因子网络

通过TP63阳性细胞的scRNA-seq分析发现，2周时表面外胚层(SE)分化为增殖型SE和眼表外胚层(OSE)，RNA速度分析显示分化轨迹为增殖SE→SE→OSE。SCENIC分析揭示OSE中PAX6调节子活性最高，与TFAP2C形成核心调控网络。

4周时角膜-结膜谱系分叉及其转录因子网络

4周时鉴定出原始角膜上皮细胞(PCECs)和原始结膜上皮细胞(PCjECs)，后者同时表达缘膜标志物(KRT15、CEBPD、SOX9)和结膜标志物(KRT4/KRT13)。整合分析显示PCECs与胎儿角膜上皮聚类，而PCjECs与胎儿结膜上皮相似，证实结膜谱系贡献于缘膜发育。

8周眼表上皮细胞的PAX6转录网络

分化8周时明确形成角膜上皮细胞(CECs)、缘膜上皮细胞(LECs)和结膜上皮细胞(CjECs)三大谱系。免疫荧光显示PAX6高表达区域富集角膜标志物KRT12，低表达区域富集结膜标志物KRT13。PAX6与结膜角蛋白(KRT4/KRT7/KRT13)表达呈显著负相关。

PAX6表达水平决定眼表上皮细胞片特性

通过PAX6表达梯度分选获得的细胞片中，高PAX6组(P4)表达角膜标志物KRT12/ALDH3A1，中低PAX6组(P3)表达结膜杯状细胞标志物MUC5AC，而PAX6阴性组(P1/P2)呈现表皮特征(KRT10阳性)，证实PAX6剂量决定上皮命运选择。

这项研究首次在单细胞分辨率下揭示了人类眼表上皮的发育轨迹，阐明了PAX6活性梯度调控谱系分化的分子机制。发现结膜谱系细胞在发育早期即具备向缘膜上皮分化的潜能，为缘膜干细胞(LSCs)的胚胎起源提供了直接证据。通过建立PAX6表达水平与上皮命运决定的定量关系，不仅深化了对眼表发育的认识，也为眼表疾病的干细胞治疗提供了理论依据。特别是PAX6中低表达可诱导功能性结膜上皮的发现，为结膜缺损再生策略开辟了新思路。研究建立的双报告系统与类器官平台，将成为探索眼表发育障碍疾病(如无虹膜症相关角膜病变)发病机制的强有力工具。