基于Azide-A-DSBSO体内交联与二维富集技术的蛋白质互作组全景研究新策略

本研究针对蛋白质相互作用(PPI)研究中传统方法(如免疫共沉淀、酵母双杂交)存在的抗体依赖性和原生环境破坏等局限，开发了基于Azide-A-DSBSO交联剂的体内交联质谱(XL-MS)新方法。通过优化亲和富集与尺寸排阻色谱(SEC)的联用策略，在K562细胞核提取物中鉴定到393个PPI（含56个新型互作），并揭示DEAD-box RNA解旋酶DDX39B可能存在单体/二聚体动态平衡。该工作为研究低丰度蛋白互作及瞬时相互作用提供了高效技术路径。

　　

在生命科学领域，蛋白质如同微观世界的社会网络，它们的相互作用(PPI)决定着细胞的命运。然而，传统研究手段如X射线晶体学和免疫共沉淀(Co-IP)就像用拆解机器的方式研究钟表——要么需要纯化大量蛋白破坏原生环境，要么受限于抗体可用性，难以捕捉那些稍纵即逝的分子"握手"。更棘手的是，低丰度蛋白如同社交圈中的"隐形人"，现有技术往往对其束手无策。这些瓶颈严重制约着人们对癌症等疾病相关蛋白网络的认知。

来自奥地利科学院分子病理研究所(Research Institute of Molecular Pathology, IMP)的研究团队在《Communications Chemistry》发表突破性成果。他们开发了一套基于Azide-A-DSBSO交联剂的体内交联质谱(XL-MS)技术方案，通过磁性微球亲和富集与尺寸排阻色谱(SEC)的"双保险"策略，在人类K562细胞中绘制出包含5000+交联位点的互作图谱，其中核提取物数据特别揭示了RNA解旋酶DDX39B的二聚化现象，为癌症靶点研究开辟了新视角。

关键技术包括：(1)2 mM Azide-A-DSBSO体内交联反应；(2)DBCO修饰磁性微球富集交联肽段；(3)SEC分级去除单链接肽干扰；(4)Orbitrap Eclipse质谱仪结合FAIMS Pro接口的Top10数据依赖采集；(5)MS Annika 3.0算法进行交联肽段鉴定。实验使用CRISPR标记的DDX39B-GFP K562细胞系验证核定位。

优化富集流程

比较Cytiva与Cube Biotech磁性微球性能时发现，在模拟复杂基质中，Cytiva微球使Cas9交联肽段回收率提升314%。

关键改进在于省略C18纯化步骤后，线性肽背景降低38%，证明盐离子可抑制非特异性吸附。

K562细胞验证实验

SEC分级数据显示，仅分析单个馏分即可获得90%交联位点，大幅提升通量。

使用5659个蛋白的自建数据库时，核提取物中DDX39B交联信号强度比全细胞样本高3倍，凸显亚细胞分馏对低丰度蛋白研究的价值。

DDX39B结构解析

荧光显微证实DDX39B-GFP定位于DAPI染色区域。

通过39个交联位点重构其三维构象，77%位点符合AlphaFold3预测的35?距离阈值。特别发现DDX39A/B异源二聚体可能存在的结构证据，这与mRNA出核调控机制密切相关。

全景PPI网络

核提取物数据包含333个非模糊PPI，其中14%（56个）为STRING数据库未收录的新互作。

关键发现包括：(1)DDX39B与mRNA加工因子CHTOP的互作验证；(2)剪接体、DNA复制复合体等核心机器的多组份互作图谱；(3)蛋白丰度跨越5-6个数量级仍被检测，证明方法灵敏度。

这项研究建立了迄今最简便的体内交联质谱方案，其"磁性微球富集+SEC分级"的双维策略显著提升低丰度蛋白检测能力。特别在RNA解旋酶DDX39B研究中，首次提供其可能以动态单体/二聚体平衡状态存在的实验证据，为理解其在前列腺癌中的异常调控机制奠定基础。该方法突破传统技术对膜通透性、交联效率的限制，为药物靶点发现和蛋白质机器研究提供了标准化工具包。未来通过整合AlphaLink2等AI预测平台，有望实现从静态互作图谱到动态构象变化的全面解析。