计算结构优化增强IL13Rα2-B7-H3串联CAR T细胞克服抗原异质性介导的肿瘤逃逸

针对肿瘤抗原异质性和下调导致的CAR T细胞治疗逃逸问题，研究人员通过计算结构优化设计IL13Rα2-B7-H3串联CAR，系统性评估24种构建体后，利用AbLIFT算法改造scFv"问题区域"，成功恢复表面表达并增强双抗原靶向功能，显著提升体内外抗肿瘤效果，为合成蛋白设计提供新范式。

　　

肿瘤免疫治疗领域面临的核心挑战之一是抗原异质性导致的治疗逃逸。尽管嵌合抗原受体（CAR）T细胞在血液肿瘤中取得突破，但实体瘤中普遍存在的抗原丢失或下调现象严重限制疗效。以脑肿瘤为例，IL13Rα2抗原的动态下调常导致治疗失败，而B7-H3虽表达稳定但单靶点治疗易产生逃逸克隆。如何设计能同时靶向多个抗原的CAR T细胞，成为突破当前治疗瓶颈的关键。

美国圣犹达儿童研究医院（St. Jude Children's Research Hospital）的Michaela M. Meehl团队在《Molecular Therapy》发表的研究，通过计算结构生物学方法破解了这一难题。研究人员发现，将IL13Rα2与B7-H3单链抗体片段（scFv）串联设计的原始CAR（C#1）竟完全无法在T细胞表面表达。通过系统性构建24种变体，他们锁定问题根源——IL13Rα2 scFv可变重链（VH）的34-66氨基酸区域会引发蛋白异常积聚。借助AlphaFold2结构预测和AbLIFT算法，团队对该"问题区域"进行多点位突变优化，最终获得表面表达率达65%的高效串联CAR（C#24），其抗肿瘤效果显著优于单靶点CAR，并能清除含5%抗原阴性细胞的异质性肿瘤。

关键技术包括：（1）流式细胞术检测CAR的胞内/表面表达；（2）构建Daoy细胞抗原敲除模型验证双靶点功能；（3）超分辨率显微镜观察CAR蛋白定位；（4）基于AlphaFold2和AbLIFT的计算结构优化；（5）颅内移植瘤模型评估体内疗效。

原始IL13Rα2-B7-H3串联CAR无法胞外表达

初始设计的C#1在胞内表达良好（66%），但表面表达仅5%，且无法杀伤Daoy细胞。调整scFv排列顺序（C#4-C#8）或连接肽（C#20-C#23）均未解决问题，提示存在更深层结构缺陷。

串联CAR"问题区域"位于IL13Rα2 VH

分段删除实验显示，完全删除IL13Rα2 scFv（C#9）可恢复表达，而仅删除其VH（C#12）部分有效，精确定位至34-66氨基酸区域。33氨基酸片段删除（C#13-C#14）使表面表达提升，但11氨基酸删除（C#17-C#19）效果有限，表明该区域存在复杂构象问题。

AbLIFT优化"问题区域"挽救CAR表达

对C#21进行AbLIFT计算优化，选择FRDNKNPH突变组合（C#24），使FoldX能量降低0.05 kcal mol^-1，聚集倾向评分改善。优化后CAR表面表达提升8倍，杀伤效率与B7-H3单靶点CAR相当，且能通过双抗原激活IFN-γ分泌。

胞内积聚的CAR不引发强直信号

显微镜显示低表达CAR在胞内形成大聚集斑（面积与表面表达负相关），但流式检测未发现4-1BB、CD25等激活标志物升高，PD-1等耗竭标志物也无变化，排除异常激活风险。

串联CAR T细胞通过双scFv发挥功能

在Daoy混合肿瘤模型（含B7-H3 KO、IL13Rα2 KO和双KO细胞）中，C#24清除效率显著优于单靶点CAR（p<0.0001）。颅内模型证实其可清除含5%抗原阴性细胞的肿瘤，而B7-H3 CAR治疗后残留肿瘤均为B7-H3阴性克隆。

优化策略具普适性

相同突变应用于IL13Rα2-GD2（C#27）和IL13Rα2-HER2（C#29）串联CAR时，均能提升表达或功能，证实计算优化的广泛适用性。

这项研究开创性地揭示：串联CAR的设计障碍可能源于scFv内在结构冲突，而传统经验式优化（如调整连接肽或序列顺序）效果有限。通过计算结构生物学指导的精准改造，不仅能破解表达难题，还可增强蛋白稳定性。更重要的是，双靶点设计将抗原阳性细胞阈值从85%降至5%，通过"旁观者效应"显著拓宽治疗窗口。该策略为开发其他多靶点合成受体（如TCR融合蛋白）提供范式，也凸显人工智能在生物医药设计中的变革潜力。未来需进一步探究CAR积聚的分子机制，并评估优化结构对长期抗肿瘤功能的影响。