基于荧光寿命的FLIM-timer技术实时监测活细胞中转录因子Nrf2蛋白周转

研究人员针对低表达/非均匀表达蛋白（如转录因子Nrf2）的稳定性监测难题，开发了结合sfGFP与mCherry的FLIM-timer基因标签，通过荧光寿命成像（FLIM）测量FRET效率，实现了对Nrf2在细胞不同区室周转差异的高精度可视化。该技术成功验证了萝卜硫素（SFN）对Nrf2的稳定作用，并拓展至细胞周期调控蛋白Cyclin B1的降解监测，为蛋白质动态研究提供了普适性新工具。

　　

在细胞应对氧化应激的过程中，转录因子Nrf2（Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor 2）作为抗氧化反应的核心调控因子，其蛋白稳定性直接决定细胞防御能力。然而，Nrf2在稳态条件下半衰期仅约20分钟，通过Keap1-Cullin3-RBX1泛素连接酶复合体持续降解。尽管已有荧光计时器（FT）技术可用于蛋白周转研究，但传统方法依赖荧光强度比值，难以精准检测低表达或分布不均的蛋白如Nrf2。这一技术瓶颈阻碍了人们对Nrf2在亚细胞区室动态变化的认知，也限制了针对Nrf2调控药物的开发评估。

针对这一挑战，来自英国邓迪大学（University of Dundee）的研究团队在《Scientific Reports》发表创新性研究，开发出基于荧光寿命成像（FLIM）的FRET计时器（FLIM-timer）。该技术将快速成熟的FRET供体sfGFP与慢速成熟的受体mCherry通过短肽连接，利用mCherry成熟过程中FRET效率的变化，通过荧光寿命衰减反映蛋白"年龄"。这种强度无关的测量方法首次实现了Nrf2在核质区室周转差异的可视化，并证实Keap1依赖与非依赖（如SCF^β-TrCP）降解途径对Nrf2的协同调控。

研究主要采用四大关键技术：1）构建sfGFP-mCherry双荧光标签的FLIM-timer载体系统；2）通过时间相关单光子计数（TCSPC）进行FLIM-FRET测量；3）建立多西环素诱导的U2OS-FRT/TO稳定细胞系实现Nrf2与Keap1的化学计量表达；4）CRISPR-Cas9介导的内源性Cyclin B1基因标记。

【FLIM-timer作为蛋白质周转的读数】

研究团队设计的FLIM-timer标签中，mCherry作为FRET受体的能力随成熟过程逐渐增强。通过比较荧光寿命与传统的mCherry/sfGFP强度比，发现前者在低信号区域变异系数（CV）仅为1.99%，远低于比值法的46.77%。

显示，核内Nrf2荧光寿命（~2200 ps）显著短于胞质（~2400 ps），提示核内更稳定。这种差异在N端标记的Nrf2中尤为显著，而C端标记则显示相反趋势，反映不同降解途径（Keap1与SCF^β-TrCP）的区室化调控。

【监测药物诱导的Nrf2稳定化】

在Keap1共表达的U2OS细胞中，萝卜硫素处理2小时使Nrf2荧光寿命缩短约50 ps，对应半衰期延长。

显示该效应同时发生在胞核与胞质，支持Keap1抑制可阻断全细胞区室的Nrf2降解。通过删除N端（ΔNd）或C端（ΔCd）降解信号证实，FLIM-timer能区分不同E3连接酶对Nrf2的调控贡献。

【追踪Cyclin B1的有丝分裂降解】

将FLIM-timer应用于内源性标记的Cyclin B1，

显示Mps1激酶抑制剂AZ3146处理10分钟后，荧光寿命即开始回升至未淬灭水平（~2176 ps），对应APC/C^CDC20介导的蛋白降解。时间推移成像成功捕捉到G2期细胞中Cyclin B1稳定性逐渐升高的动态过程。

这项研究开创性地将荧光寿命测量与蛋白质成熟动力学相结合，突破了传统荧光计时器的灵敏度限制。其技术优势主要体现在三方面：1）适用于低表达量蛋白；2）消除细胞自发荧光干扰；3）可解析亚细胞区室的蛋白稳定性差异。该技术不仅为Nrf2调控机制研究提供新视角，更建立了普适性的蛋白动态分析平台，对开发靶向蛋白降解（PROTAC）药物具有重要应用价值。研究团队特别指出，FLIM-timer未来可拓展至自噬流监测、蛋白质质量控制等更广泛领域，为细胞生物学研究提供全新维度的时间分辨率。