Src/Fas2依赖的Ephrin磷酸化通过Rac1启动Eph/Ephrin反向信号通路调控果蝇脑柱状结构形成

研究人员针对神经发育中柱状结构形成的分子机制这一关键问题，开展了关于Ephrin/Eph双向信号通路的研究。通过构建Ephrin特异性抗体和基因修饰果蝇模型，发现Ephrin在R7神经元中的酪氨酸磷酸化受Src激酶和Fas2调控，形成Ephrin/Src/Fas2复合物，进而通过下游效应因子Rac1介导反向信号传导。该研究首次在体内揭示了Eph/Ephrin双向排斥信号调控神经元形态和空间定位的分子机制，为神经环路发育提供了新见解。

　　

在神经系统的精密构造中，柱状结构作为基本功能单元，其形成机制一直是发育神经科学的未解之谜。虽然已知Ephrin/Eph信号系统在多种发育过程中发挥重要作用，但这一双向信号通路（Ephrin既可作Eph配体介导正向信号，又可作受体介导反向信号）如何参与柱状结构的构建仍不清楚。更关键的是，Ephrin酪氨酸磷酸化的体内调控机制及其生物学意义始终缺乏直接证据。

为解决这些问题，金泽大学（Kanazawa University）的研究团队以果蝇脑为模型，开展了一项突破性研究。他们发现Ephrin和Eph通过双向排斥信号精确调控柱状神经元的形态和空间定位，相关成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。研究采用的关键技术包括：构建特异性识别磷酸化和非磷酸化Ephrin的抗体；利用果蝇遗传学工具进行神经元特异性基因敲除和过表达；通过免疫共沉淀验证蛋白互作；结合共聚焦显微镜和图像分析量化神经元形态变化。

研究结果部分，作者通过系列实验揭示了以下重要发现：

Ephrin/Eph信号是柱状神经元组织的必要条件

在Ephrin和Eph缺失突变体中，核心柱状神经元R7、R8和Mi1的生长锥形态严重紊乱。R7轴突生长锥异常扩大，R8生长锥侵入中央区域，Mi1神经突破坏网格状模式，表明双向信号对维持神经元空间排列至关重要。

磷酸化与非磷酸化Ephrin呈现互补分布

通过新开发的Ephrin抗体（#1识别磷酸化形式，#2识别非磷酸化形式），发现磷酸化Ephrin#1呈点状分布于R7生长锥，而非磷酸化Ephrin#2呈网格状分布于R8和Mi1。免疫印迹证实抗体特异性，且Ephrin磷酸化依赖其胞内域酪氨酸残基。

R7中Ephrin自主调控柱状神经元组织

R7特异性敲除Ephrin导致其生长锥扩大和R8生长锥侵入中央区，过表达结合缺陷型Ephrin^E320K产生类似表型。MARCM克隆分析证实Ephrin在R7中通过细胞自主和非自主机制调控神经元排列。

R8中Eph调控Ephrin磷酸化和反向信号

R8中Eph敲除降低相邻R7的Ephrin#1信号，而过表达Ephrin^E320K抑制磷酸化。表明Ephrin磷酸化需要R8中Eph与R7中Ephrin的反式相互作用。

酪氨酸磷酸化是反向信号的关键

突变Ephrin胞内域酪氨酸（Ephrin^2YF）显著降低磷酸化水平并破坏神经元排列，证实酪氨酸磷酸化对反向信号传导的必要性。

Src激酶和Fas2调控Ephrin磷酸化

RNAi筛选发现Src42A是主要酪氨酸激酶，其与Fas2共同形成Ephrin/Src/Fas2复合物。Fas2胞内域亚型（PA+/PA-）能部分挽救Ephrin缺失表型，证实其在信号复合物组装中的作用。

Rac1介导下游信号传导

表达显性负性Rac1^L89模拟Ephrin缺失表型，而Fas2过表达的表型可被Rac1^L89抑制，表明Rac1是Eph/Ephrin反向信号的关键效应因子。

这项研究首次在体内揭示了Eph/Ephrin双向信号调控神经环路的分子机制。特别重要的是，研究人员阐明了Ephrin磷酸化如何通过Src/Fas2复合物启动，进而通过Rac1调控神经元形态的完整通路。该发现不仅为理解果蝇视觉系统发育提供了新视角，更因其在进化上的保守性，为研究哺乳动物大脑皮层柱状结构形成机制提供了重要参考。从转化医学角度看，Ephrin/Eph信号异常与多种神经系统疾病相关，这项基础研究可能为相关疾病的机制解析提供新思路。