ptsH突变通过增强碳分解代谢抑制缓解cpgA突变体的代谢毒性及抗生素敏感性

这篇研究揭示了Bacillus subtilis中CpgA蛋白的双重功能：除参与核糖体组装外，还能通过水解毒性代谢物4-磷酸赤藓糖醇（4PE）维持代谢稳态。研究发现ptsH-G54D突变通过增强碳分解代谢抑制（CCR）限制葡萄糖酸摄入，从而补偿ΔcpgA突变导致的代谢紊乱和抗生素敏感性，为理解细菌代谢纠错机制提供了新视角。

　　

代谢纠错与生存策略的分子博弈

ABSTRACT

Bacillus subtilis的CpgA蛋白作为环形排列GTPase（circularly permuted GTPase），不仅参与30S核糖体亚基组装，还具有代谢纠错功能——水解由甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）催化产生的毒性代谢物4-磷酸赤藓糖醇（4PE）。ΔcpgA突变体因4PE积累导致中央碳代谢紊乱，表现为生长缺陷和肽聚糖合成抑制剂敏感性。研究团队发现ptsH-G54D突变能显著改善ΔcpgA突变体在葡萄糖和葡萄糖酸双重压力下的生存能力，其机制涉及磷酸载体蛋白（HPr）变构调控碳代谢网络。

INTRODUCTION

CpgA的同源物RsgA在大肠杆菌中已被证实参与核糖体成熟过程。然而，Bacillus subtilis的CpgA展现出独特的"兼职"功能：当戊糖磷酸途径（PPP）中间产物赤藓糖-4-磷酸（E4P）被GAPDH错误磷酸化生成4PE时，CpgA能及时水解这种毒性代谢物。缺乏CpgA会导致4PE抑制6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（GndA），进而引发6-磷酸葡萄糖酸堆积并抑制磷酸葡萄糖异构酶（Pgi），最终造成代谢僵局。

RESULTS AND DISCUSSION

ptsH-G54D的拯救机制

通过CRISPR构建的ΔcpgA ptsH-G54D突变体在含葡萄糖和葡萄糖酸的培养基中表现出显著生长恢复，而ptsH完全缺失则无此效果，证实G54D是功能获得性突变。有趣的是，该突变不影响磷酸转移酶系统（PTS）介导的果糖摄取能力，但通过增强glcT抗终止蛋白调控的ptsG表达，显示出更活跃的葡萄糖感应机制。

GAPDH的代谢双面性

实验证实GAPDH对E4P的催化效率（k_cat/K_M=1.05 mM^-1s^-1）虽比天然底物G3P低200倍，但在体内E4P浓度（~1mM）显著高于G3P（120μM）的情况下，仍会产生可观量的4PE。通过AlphaFold多聚体建模预测，HPr-S46-P与GapA的相互作用可能改变其底物选择性，但酶动力学数据显示HPr-G54D对4PE合成的抑制效果有限。

碳代谢重编程的核心作用

关键证据来自对葡萄糖酸操纵子（gntRKPZ）的调控分析：ptsH-G54D使CCR效应增强3-4倍，显著降低gntP表达。这种"代谢节流"策略与早期发现的zwf突变形成互补——前者限制葡萄糖酸摄入，后者减少葡萄糖向PPP的分流。当引入模拟磷酸化的HPr-S46E突变时，ΔcpgA的拯救效应消失，证实Ser46磷酸化对CCR调控至关重要。

保守性与特异性

来自Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes等革兰氏阳性菌的CpgA同源物均能补偿B.subtilis ΔcpgA的代谢缺陷，但大肠杆菌RsgA仅能部分挽救核糖体组装缺陷，暗示代谢纠错功能可能在厚壁菌门中特异保留。

抗生素敏感性的代谢根源

ΔcpgA对β-内酰胺类（头孢呋辛、青霉素）和磷霉素的敏感性源于Pgi抑制引发的氨基糖合成障碍。ptsH-G54D通过恢复代谢流，使头孢呋辛抑菌圈直径从28±1mm降至18±1mm（P<0.001），证实代谢稳态与细胞壁合成的紧密关联。

MATERIALS AND METHODS

研究采用CRISPR-Cas9基因组编辑、His标签蛋白纯化、酶动力学分析（使用砷解反应监测NADH生成）等多学科手段。特别值得注意的是，通过计算体内代谢物浓度与酶参数，首次量化了GAPDH"地下代谢"（underground metabolism）的实际贡献率——约4%的酶周转用于生成毒性副产物。

这项研究不仅揭示了细菌应对代谢毒性的新型调控网络，还为理解抗生素敏感性背后的代谢基础提供了新视角。天然存在的ptsH-G54D变异（如某些Paenibacillus菌株）可能代表了一种进化适应的分子印记，通过精细调控碳代谢流向换取生存优势。