超嗜热酯酶EstE1催化His环柔性驱动高活性与结构稳定性的分子机制

这篇研究揭示了超嗜热酯酶EstE1通过独特的催化His环（Gly282介导）柔性实现高温下高活性与结构稳定性的平衡机制。通过对比EstE1与中温酯酶rPPE的突变体（G282N/Q和D287G/E），结合荧光淬灭、分子动力学（MD）模拟和酶动力学分析，发现Gly282维持的局部柔性是EstE1催化效率（kcat达2900 s-1）的关键，而rPPE依赖氢键网络（Asp287-Asn158）稳定活性中心。该研究为理性设计耐热酶提供了新范式。

　　

ABSTRACT

超嗜热酯酶EstE1在70°C下展现惊人的催化速率（k_cat 2900 s^-1），远超中温酯酶rPPE（k_cat 2.0 s^-1）。研究聚焦其催化His环（His281-Gly282）的柔性特征，发现Gly282通过减少空间位阻促进环区动态变化，而rPPE的Asp287则通过氢键（与Asn158/Trp187）锁定构象。突变实验显示，EstE1的G282N/Q因引入氢键或空间位阻降低活性，而rPPE的D287G通过破坏氢键提升活性153%。

INTRODUCTION

α/β水解酶家族酯酶依赖催化三联体（Ser-His-Asp/Glu）水解酯键。超嗜热酶通常具有刚性结构（如减少空腔、增强盐桥），但EstE1和AFEST等例外——其活性中心局部柔性（如Gly282）可能打破"活性-稳定性权衡"。序列比对显示，Gly282在超嗜热酯酶中保守，而中温/低温酯酶对应位点为Asp或其他极性残基。

RESULTS

蛋白表达与纯化

EstE1（35 kDa）以二聚体形式存在，rPPE（34 kDa）为单体，均通过镍柱和分子筛纯化至均一（SDS-PAGE验证）。

酶活性

EstE1的G282N/Q在70°C保留71%/65%活性，但在30°C骤降至54%/32%；rPPE的D287G在30°C活性提升至153%，D287E因形成更强氢键（Glu287-Asn158）使k_cat/K_m提高5.5倍。

荧光与构象分析

EstE1的Tyr182主导内源荧光，其渐变式淬灭（4°C→90°C）反映局部构象变化。G282N因意外形成Ser285氢键增加刚性，G282Q则因谷氨酰胺侧链干扰增强波动。rPPE的D287G因氢键缺失导致β2环（RMSF↑2?）波动加剧。

分子动力学模拟

EstE1的G282Q使整体RMSD升至1.6?，尤其影响β1环（56-57位）和α6螺旋（207-219位）；rPPE的D287G使α4螺旋（RMSF↑3?）剧烈波动，与实验数据一致。

DISCUSSION

1. 1.

   柔性策略分化：EstE1通过"刚性骨架+柔性His环"实现高温高效催化，而rPPE以"柔性骨架+刚性活性中心"适应中温环境。

2. 2.

   芳香残基温度适配：超嗜热酶偏好Tyr182（羟基氢键），中温酶倾向Trp187（疏水堆叠），如EstE1的Y182W突变会因位阻 destabilize结构。

3. 3.

   工程启示：在EstE1中引入Gly类似物或可增强工业酶性能，而rPPE的D287E设计提升了底物亲和力（K_m↓6倍）。

MATERIALS AND METHODS

研究采用pET28载体表达蛋白，通过定点突变（EZchange试剂盒）构建变异体。酶活检测使用pNP己酸酯（EstE1）和pNP乙酸酯（rPPE），动力学参数由Lineweaver-Burk图计算。荧光淬灭（0-0.5M丙烯酰胺）和圆二色谱（JASCO J-1500）解析构象变化，MD模拟（OPLS4力场，100ns）在Schr?dinger平台完成。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献结论）