应激颗粒介导的ZBP1-RIPK3通路驱动非梗阻性无精症与睾丸衰老中的坏死性细胞死亡

这篇开创性研究揭示了男性不育的新机制：环境或生理应激通过eIF2α激酶诱导应激颗粒（SG）形成，招募ZBP1和RIPK3形成复合体，激活MLKL磷酸化（p-MLKL），导致精原细胞和支持细胞坏死性死亡（necroptosis）。研究证实该通路在非梗阻性无精症（NOA）患者睾丸中100%激活，并通过基因敲除（Zbp1?/?/Ripk3?/?）小鼠模型验证其对热应激性睾丸退化的保护作用，为男性生殖衰退提供了跨病理（NOA）与生理（衰老）的统一理论框架。

　　

应激颗粒介导的ZBP1激活驱动睾丸退行性病变

患者队列与睾丸组织病理学

研究纳入50例非梗阻性无精症（NOA）患者和17例睾丸扭转对照，通过约翰森评分（Johnsen Score≤7）证实NOA患者睾丸存在完全生精障碍。值得注意的是，10例隐睾病史患者表现出更强的p-MLKL信号，提示温度升高可能促进坏死性死亡。

磷酸化MLKL在NOA睾丸中的特异性激活

免疫组化显示p-MLKL在100% NOA患者的生精小管中富集，而对照组完全缺失。肽段竞争实验和λ蛋白磷酸酶预处理验证了抗体特异性。Western blot进一步在NOA患者睾丸中检测到RIPK3和p-MLKL，且凋亡标志物cleaved caspase-3阴性，支持坏死性凋亡的主导地位。

RIPK3而非RIPK1驱动MLKL活化

NOA样本中未检测到p-RIPK1，表明RIPK3通过非经典途径激活。细胞实验证实，在干扰素-β（IFN-β）预刺激后，热休克（43°C）可诱导GC-2spd（精母细胞）和15P-1（支持细胞）发生ZBP1依赖性死亡，而缺乏RIPK3的MA-10（间质细胞）则完全抵抗。

ZBP1-RIPK3复合体的分子机制

结构域分析揭示，ZBP1的Zα结构域和RHIM基序对其功能至关重要：缺失Zα结构域或RHIM突变的ZBP1无法恢复Zbp1^?/?细胞的死亡表型。共免疫沉淀证实IFN-β/热休克后ZBP1与RIPK3形成复合体，且G3BP1/2双敲除细胞完全抵抗坏死性凋亡，证实应激颗粒作为分子支架的必要性。

eIF2α激酶的层级调控

四重敲除（PKR/HRI/PERK/GCN2）细胞中，IFN-β/热休克诱导的坏死性凋亡被完全阻断。临床样本显示90% NOA患者存在p-GCN2，46%存在p-PKR，且信号与p-MLKL共定位，而p-PERK几乎无表达，提示GCN2/PKR是主要效应激酶。

衰老睾丸中的保守通路

30例老年前列腺癌患者睾丸中，96.7%检出p-MLKL和p-GCN2，生精小管G3BP1颗粒显著增多。与NOA类似，衰老睾丸中应激颗粒-ZBP1-RIPK3轴持续激活，将病理性与生理性睾丸衰退联系起来。

动物模型的验证

小鼠阴囊43°C间歇热暴露实验表明，Ripk3^?/?和Zbp1^?/?小鼠睾丸重量和生精小管结构得到显著保护，且p-MLKL信号消失，证实该通路在体内的必要性。

理论与临床意义

该研究首次建立"应激颗粒-ZBP1-RIPK3-MLKL"轴作为睾丸退行性变的共同通路：环境应激通过GCN2/PKR激活eIF2α，促使应激颗粒招募ZBP1，通过RHIM基序激活RIPK3，最终导致生精上皮不可逆损伤。值得注意的是，睾丸组织组成性表达ZBP1的特性，使其成为应激敏感器官，这为开发针对RIPK3或ZBP1的小分子抑制剂提供了理论依据。