聚乙二醇化和透明质酸功能化对脂质体介导mRNA在犬视网膜递送的影响

这篇研究通过优化脂质体-mRNA复合物（lipoplexes）的制备工艺，系统评估了聚乙二醇（PEG）衍生物（包括PEG-DMG和透明质酸偶联的HA-PEG-DPPE）对纳米颗粒稳定性、细胞摄取效率的影响，并在犬模型中验证了其视网膜递送效果。研究发现，PEGylation显著提升lipoplexes的稳定性（维持48小时粒径和zeta电位），而亚视网膜注射可实现mRNA在全视网膜细胞（包括光感受器）的高效递送，但蛋白表达仅局限于视网膜色素上皮（RPE）。该研究为开发非病毒载体（non-viral vectors）视网膜基因治疗提供了关键实验依据。

　　

材料与方法

研究采用Lipofectamine? MessengerMAX（LP）作为阳离子脂质载体，在纯水中优化mRNA脂质复合物（lipoplexes）的组装工艺，体积重量比（v/w）为2.5时实现90%以上的mRNA包封率。通过动态光散射（DLS）测定，未修饰的lipoplexes粒径为98.7-121.5 nm，zeta电位介于-14.4至-58.7 mV。选用四种PEG衍生物（PEG-DMG、PEG-DSPE、HA-PEG-DPPE和PEG-HA-DPPE）进行表面修饰，其中PEG-DMG和HA-PEG-DPPE修饰的lipoplexes在48小时内保持稳定的粒径和表面电位。体外实验使用RAW264.7巨噬细胞和ARPE-19视网膜色素上皮细胞系，通过RNA原位杂交（RNA-ISH）和免疫荧光评估转染效率。

体外实验结果

PEGylation使RAW264.7细胞的转染效率降低1.5-2倍，但ARPE-19细胞仍保持较高转染率（约65%）。竞争性实验表明，透明质酸（HA）预处理可抑制HA-PEG-DPPE lipoplexes的摄取，证实CD44受体介导的内吞途径。值得注意的是，尽管两种细胞均能100%摄取PEGylated lipoplexes（RNA-ISH验证），但蛋白表达水平差异显著，提示细胞内加工（如内体逃逸效率）是限速步骤。玻璃体模拟实验显示，其凝胶结构使lipoplexes转染效率下降23-52%，印证了眼内递送的物理屏障。

犬视网膜递送研究

亚视网膜注射PEG-DMG和HA-PEG-DPPE lipoplexes 24小时后，RNA-ISH检测到注射区所有视网膜层（包括光感受器）存在eGFP mRNA，其在外核层（ONL）的积累量与内源性视紫红质（RHO）mRNA相当。激光捕获显微切割（LCM）定量显示，PEG-DMG组ONL的eGFP拷贝数达RHO的1.8倍。然而，eGFP蛋白仅表达于RPE，72小时后其他视网膜层的mRNA呈斑片状分布。有趣的是，两种PEGylated制剂在视网膜内层的蛋白表达模式迥异：PEG-DMG组见于Müller胶质细胞，而HA-PEG-DPPE组分布于内核层（INL）和神经节细胞层（GCL），可能与表面吸附的蛋白冠（protein corona）差异有关。

机制探讨

研究提出三个关键发现：

1. 1.

   扩散效率：PEGylated lipoplexes可突破外界膜（OLM）扩散至全视网膜，但玻璃体注射因玻璃体-视网膜界面屏障导致递送效率低下。

2. 2.

   细胞特异性降解：神经元细胞（如光感受器）中mRNA的快速降解可能与其特有的内体分选或mRNA沉默机制（如应激颗粒 sequestration）相关。

3. 3.

   UTR设计影响：商用eGFP mRNA的5'UTR（含Kozak序列）和3'UTR（α-珠蛋白来源）可能未针对视网膜神经元优化，影响翻译持续性。

应用前景

该工作建立了适用于大动物模型的lipoplexes制备标准流程，为CRISPR/Cas9 mRNA递送等瞬时基因治疗奠定基础。未来需探索视网膜神经元特异的UTR优化策略，并开发穿透玻璃体屏障的新型纳米载体。