自扩增mRNA疫苗表达PRV gD蛋白可有效诱导针对强毒株变异的免疫保护

针对传统伪狂犬病病毒(PRV)疫苗对流行变异株保护不足的问题，本研究开发了基于VEEV复制子的自扩增mRNA(saRNA)疫苗。该疫苗仅需5μg剂量即可在仔猪中诱导强效体液与细胞免疫，对高毒力PRV变异株攻击提供完全保护，其效果显著优于传统减毒活疫苗和灭活疫苗，为α疱疹病毒亚科疫苗研发提供了新范式。

　　

伪狂犬病病毒(PRV)作为α疱疹病毒亚科的重要成员，近年来在我国猪群中出现了突破传统疫苗保护的强毒变异株，导致新生仔猪致命性脑炎、育肥猪生长迟缓和母猪繁殖障碍等严重问题。更令人担忧的是，2020年首次从人类脑脊液中分离到PRV毒株，暗示其潜在的人畜共患风险。传统灭活疫苗和gE基因缺失的Bartha-K61减毒活疫苗对流行变异株的保护效果有限，亟需开发新型疫苗技术应对这一挑战。

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的研究团队创新性地采用自扩增mRNA(saRNA)技术平台，基于委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)复制子系统，构建了表达PRV变异株糖蛋白D(gD)的疫苗。该研究通过系统的动物实验证明，这种新型疫苗不仅能克服传统疫苗的局限性，还展现出剂量优势和创新潜力，相关成果发表在《npj Vaccines》期刊。

研究团队主要采用以下关键技术：1)基于VEEV的saRNA载体构建与体外转录系统验证；2)密码子优化的gD基因设计与HiBiT标签表达检测；3)脂质纳米颗粒(LNP)封装工艺优化；4)小鼠和仔猪分层剂量免疫实验设计；5)病毒中和抗体测定与细胞因子(IFN-γ/IL-4)检测；6)高毒力PRV AH02LA株攻毒保护实验。实验动物包括BALB/c小鼠和4周龄断奶仔猪。

【Generation of saRNA vaccines based on PRV gD】

研究人员首先设计包含VEEV非结构蛋白和gD基因的saRNA构建体，通过体外转录获得完整性达87%的mRNA。在HEK-293细胞中验证报告基因表达后，选择在ST和PK-15细胞中高效表达的gD2变异体进行后续研究。LNP封装后颗粒平均粒径73.24nm，多分散系数0.120，zeta电位-1.72mV，符合疫苗递送要求。

【Immunogenicity of gD mRNA vaccines in mice】

小鼠实验显示，100ng剂量saRNA-gD二次免疫诱导的中和抗体滴度(1:218.5)显著高于灭活疫苗。血清细胞因子检测发现IFN-α和IL-12水平显著升高，组织病理学评估证实疫苗安全性良好。

【Immune responses induced by the saRNA-gD vaccine in piglets】

仔猪实验中，5μg saRNA-gD二次免疫组在35天时中和抗体滴度达1:200，显著高于活疫苗(1:23)和灭活疫苗(1:23)组。细胞免疫应答方面，该组IFN-γ和IL-4水平分别比对照组高3.2倍和4.5倍，显示Th1/Th2平衡激活。

【Clinical symptoms of piglets post-challenge】

攻毒实验证明，5μg二次免疫组仔猪全部无发热症状，而50μg单次免疫组出现短暂高热。传统疫苗组虽能减轻症状，但保护效果不及saRNA疫苗完全。

【Virus shedding in piglets post-challenge】

鼻腔病毒脱落检测显示，saRNA疫苗组病毒载量(10^3.33-10^6.32 TCID₅₀/mL)与活疫苗相当，但显著低于灭活疫苗组。值得注意的是，5μg二次免疫组的病毒清除速度最快。

【Pathological and histopathological changes in lungs of piglets post-challenge】

病理学分析发现，saRNA-gD二次免疫组肺组织基本保持正常结构，仅见小支气管周围轻微毛细血管淤血，qPCR证实所有检测器官均无PRV DNA残留，保护效果最为彻底。

这项研究通过创新性设计实现了三个重要突破：首先，证实单一gD抗原的saRNA疫苗即可提供完全保护，颠覆了传统PRV疫苗需要多价抗原的认知；其次，5μg超低剂量展现的强效免疫应答，大幅降低了mRNA疫苗的应用成本；最后，为α疱疹病毒亚科(包括单纯疱疹病毒HSV-1/2和水痘带状疱疹病毒VZV)疫苗研发提供了可借鉴的技术路线。特别值得注意的是，该疫苗对流行变异株的优异保护效果，为解决我国PRV防控难题提供了切实可行的解决方案，同时其安全性特征也为其他畜禽mRNA疫苗开发树立了新标准。