miR172a-ERF416/413模块调控大豆种子性状的分子机制及其在育种中的应用

本研究揭示了miR172a通过切割转录因子基因ERF416/413调控大豆种子大小和重量的新机制。该模块通过抑制细胞增殖调控因子GmKIX8-1和激活糖转运蛋白基因GmSWEET10a的表达影响种子性状，同时发现ERF416单倍型Hap1与高种子重量、Hap3与高油脂含量显著相关。研究为高油高产大豆分子设计育种提供了重要靶点和基因资源。

　　

INTRODUCTION

大豆(Glycine max)作为重要油料作物，其产量和品质受种子性状直接影响。近年研究发现GmGA20OX、GmCYP78A5等基因参与种子发育调控，而microRNA（miRNA）在植物发育中的调控作用逐渐被重视。其中miR172家族在多种植物中调控AP2/ERF转录因子，但其在大豆种子性状调控中的作用尚不明确。前期研究发现miR172a通过靶向SSAC1基因增强大豆耐盐性，但其对农艺性状的影响仍需深入探索。

RESULTS

过表达MIR172a导致种子变小

35S启动子驱动的MIR172a转基因大豆株系（OE-1/OE-7等）表现出显著表型变化：种子百粒重从对照JACK的17.01g降至6.02-9.23g，叶片变窄且开花提前约14天。值得注意的是，虽然单株产量降低，但三粒荚比例增加。种子脂肪酸总量降低（特别是18:2），而蛋白质含量上升7.7%-15.3%，暗示miR172a可能通过独立于ERF416/413的途径调控种子成分。

ERF416/413作为miR172a靶标的验证

通过miRbase预测和qPCR验证，发现ERF416（Glyma.02G087400）和ERF413（Glyma.10G116600）在转基因植株种子中显著下调。5'RACE实验证实miR172a在靶标mRNA第10-11位核苷酸间进行切割。这两种AP2/ERF家族蛋白具有典型EAR抑制结构域，酵母双杂交显示它们能形成同源/异源二聚体。原生质体实验表明ERF416/413具有转录抑制活性，当与激活域VP16融合时能强烈抑制报告基因表达。

基因编辑突变体的表型悖论

CRISPR/Cas9获得的erf416/413双突变体（erf416/413-1等）产生更小种子（百粒重降低），但单株产量反而提升13.3%-31.8%，这与miR172a过表达株系表型形成有趣对比。突变体种子脂肪酸总量增加11.7%（尤其18:1含量上升），蛋白质含量下降，表明ERF416/413可能通过独立于种子大小的途径调控油脂代谢。

ERF416过表达的互补验证

构建miR172a切割位点同义突变的rERF416（抗降解型）转化大豆，获得OE-175等株系。这些植株种子百粒重增加8.6%-13.0%，证实ERF416正向调控种子大小。值得注意的是，过表达株系油脂总量降低，与突变体表型相互印证，但蛋白含量仅部分株系显著升高，提示存在其他调控层。

下游调控网络的解析

RNA-seq分析发现：

1. 1.

   细胞增殖负调控因子GmKIX8-1在突变体中上调，EMSA和ChIP-qPCR证实ERF416/413通过结合启动子GCC-box（如P2片段）抑制其表达

2. 2.

   糖转运蛋白GmSWEET10a在突变体中下调，双荧光素酶实验显示ERF416/413通过CAACAA元件（非GCC-box）激活其表达

3. 3.

   有丝分裂相关通路基因显著差异表达，暗示该模块可能通过调控细胞周期影响种子发育

单倍型分析与育种价值

对289份大豆种质的ERF416启动子分析发现：

• •

  Hap1（71%野生型/46%栽培种）：高表达量+高百粒重

• •

  Hap3（主要栽培种）：与高油脂含量（20.79% vs Hap1的19.13%）显著相关

  地理分布显示东北地区栽培种中Hap3占比54%，而南方仅6.7%，为区域化育种提供分子标记。

DISCUSSION

该研究构建了"miR172a→ERF416/413→GmKIX8-1/GmSWEET10a"的级联调控通路，揭示转录因子双重调控机制：通过抑制GmKIX8-1（GCC-box）和激活GmSWEET10a（CAACAA元件）协同调控种子大小。值得注意的是，虽然miR172a与ERF416/413在种子大小调控上功能一致，但在脂肪酸代谢和单株产量调控上呈现"解耦"现象，暗示存在分支通路。ERF416单倍型Hap3作为高油等位基因，在南方品种中频率不足7%，具有重要育种应用潜力。

MATERIALS AND METHODS

研究采用多重技术体系：

1. 1.

   转基因：农杆菌介导的大豆子叶节转化（35S::MIR172a/rERF416）

2. 2.

   基因编辑：CRISPR/Cas9构建erf416-1/erf413-1等突变体

3. 3.

   分子互作：EMSA（GST融合蛋白）、ChIP-qPCR（GFP标记转基因毛根）

4. 4.

   表型分析：气相色谱（脂肪酸）、近红外（蛋白质）、自动化考种系统

5. 5.

   单倍型鉴定：195栽培种+94野生种3kb启动子重测序