异养硅藻Nitzschia putrida遗传转化系统的建立及其在光合作用逆向工程中的应用价值

本研究首次建立了非光合硅藻Nitzschia putrida的稳定遗传转化系统，通过生物弹道法（biolistic）结合金门克隆（Golden Gate Cloning）技术，成功利用NADH-泛醌还原酶复合体1启动子驱动转基因表达。该突破为研究真核生物光合作用丢失的进化机制提供了独特模型，并为逆向工程重构光合作用通路奠定技术基础。

　　

引言

硅藻作为水生生态系统的重要初级生产者，其进化历史可追溯至1.5-2亿年前的侏罗纪时期。其中，海洋羽纹纲硅藻Nitzschia putrida因完全丧失光合作用能力而成为罕见的自由生活型次级异养生物。其保留的质体ATP合成功能与丢失的光合作用基因形成鲜明对比，为研究真核生物代谢模式转换提供了理想模型。

材料与方法

培养条件优化：N. putrida在含0.8%琼脂糖的50% LB人工海水（16盐度）中表现最佳生长，无需光照但需200 rpm振荡培养。通过生长速率公式μ=ln(N_t/N₀)/Δt计算显示，100 μg·mL^-1 nourseothricin（Nat）可完全抑制野生型生长。

载体构建：基于转录组数据筛选出表达量最高的NADH-泛醌还原酶复合体1基因（TPM值40,741），设计L0-L2级金门克隆体系：

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  L0模块：合成1000 bp启动子区和831 bp终止子区，消除BsaI/BpiI酶切位点

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  L1组装：将Nat抗性基因与eGFP报告基因分别插入pICH47732/pICH47742骨架

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  L2终载体：通过L2E linker构建pNpNADH:NAT:eGFP，经SalI酶切和全长测序验证

转化流程：使用PDS-1000/He基因枪（1350-1550 psi爆破压力）将钨颗粒包裹的质粒导入5×10⁷指数期细胞，24小时恢复后转入含Nat的液体培养基进行14天筛选。

结果

转化效率：在9次独立转化中获得8个Nat抗性株系（成功率89%），PCR证实nat基因整合。固体培养基因细胞运动性导致菌苔蔓延，故采用液体筛选结合流式分选（FACS）获得单克隆。

eGFP表达验证：

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  RT-PCR显示转基因株系特异性扩增，野生型无信号

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  荧光显微镜观察到明显绿色荧光（550 nm激发），野生型无背景

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  生长曲线显示转基因株与野生型在最优条件下无显著差异

讨论

该技术突破解决了异养硅藻缺乏fcp启动子的技术瓶颈。NADH启动子的高效驱动能力为后续重构光驱动质子梯度（如引入psbA基因）提供了可能。值得注意的是，细胞运动性导致的克隆分离难题通过FACS创新性解决，为其他运动性微生物转化提供了参考方案。未来可应用于：

1. 1.

   解析质体ATP合酶在异养代谢中的调控网络

2. 2.

   构建最小化光合作用元件测试平台

3. 3.

   生产高价值多不饱和脂肪酸（如EPA）

技术亮点

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  首个自由生活型异养硅藻遗传操作系统

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  线粒体源启动子替代传统叶绿体启动子

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  流式分选克服运动细胞克隆分离障碍

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  保持野生型生长速率的低负荷转基因策略