"共价约束二聚体Gembody技术突破小蛋白冷冻电镜结构解析瓶颈"

冷冻电镜（cryo-EM）在解析小分子量蛋白（<100 kDa）结构时面临信噪比低、对齐困难等挑战。牛津大学团队创新性开发了共价二聚体Gembody（DiGb）技术，通过工程化纳米抗体C12位点的二硫键定向交联，成功解析了14 kDa溶菌酶至49 kDa RECQL5等蛋白的2.45-3.75?高分辨率结构。该技术通过模块化设计实现同源/异源双靶点同步解析，为膜蛋白SPNS2等难结晶靶点提供了新研究范式。

　　

在结构生物学领域，冷冻电镜（cryo-EM）虽已成为主流技术，但对小分子量蛋白（<100 kDa）的结构解析仍面临巨大挑战——人类基因组编码的蛋白质中74.5%分子量小于50 kDa，但EMDB数据库中此类结构占比不足3.5%。传统解决方案如抗体片段（Fab）或支架蛋白存在模块化不足、对称性缺失等问题，严重制约了研究效率。

牛津大学（University of Oxford）结构生物学团队在《Nature Chemical Biology》发表的研究中，基于前期发现的纳米抗体"孪晶"现象，开发出革命性的共价二聚体Gembody（DiGb）技术。该技术通过在纳米抗体框架区引入S7N/L12C/Q14K/T125M突变，利用Cu(II)催化C12位点形成二硫键，构建出兼具刚性与适度灵活性的二聚体支架。研究人员通过SEC（尺寸排阻色谱）和质谱验证，成功获得均一度达95%的DiGb复合物，并运用300 kV冷冻电镜采集数据，结合cryoSPARC非对称性局部精修策略，突破了小蛋白解析的技术瓶颈。

关键技术包括：1）工程化纳米抗体共价二聚体构建；2）DTNB介导的异源二聚体定向组装；3）非对称性冷冻电镜数据处理流程；4）生物层干涉技术（BLI）验证结合亲和力。

同源DiGb助力小蛋白结构解析

通过RECQL5（49 kDa）测试表明，DiGb5-006复合物的2D分类质量显著优于单体纳米抗体样本。采用近似C₂对称性处理结合局部精修，将分辨率从3.79?提升至3.18?。该方法同样适用于膜蛋白SPNS2（2.79?）和超小蛋白溶菌酶（14 kDa，3.16?），其中溶菌酶采用C₁对称性处理获得更优结果。

异源DiGb实现双靶点同步解析

通过DTNB氧化接力反应构建的异源DiGb（如Gb5-006:GbEnhancer），成功同时解析RECQL5（3.03?）与sfGFP（2.99?）复合结构。特别值得注意的是，该方法克服了sfGFP因空间位阻无法形成同源二聚体的局限，拓展了技术适用范围。

二硫键约束的界面特性分析

3D变异性分析（3DVA）显示所有DiGb复合物的二聚角差异<8.1°，证实共价键有效稳定了构象。比较晶体与溶液状态界面发现，Q123通过氢键网络维持界面稳定性，而M125突变形成的疏水腔对二硫键定位至关重要。

这项研究开创性地将化学共价约束与冷冻电镜技术结合，建立的DiGb平台具有三大突破：1）首次实现<50 kDa蛋白的常规化冷冻电镜解析；2）模块化设计支持同源/异源靶点自由组合；3）允许微摩尔级亲和力（K_D=23.4 μM）的纳米抗体参与结构研究。该技术为G蛋白偶联受体（GPCR）等难结晶靶点的结构功能研究提供了新工具，相关方法已申请专利保护。研究涉及的冷冻电镜图谱和原子坐标已存入EMDB（EMD-19331等）和PDB（8RL5等）数据库。