新型混合高速质谱仪Stellar MS结合15N标记蛋白实现肝病标志物的快速临床转化

本研究针对临床生物标志物验证中三重四极杆质谱技术的局限性，开发了基于Stellar MS（一种整合线性离子阱分析器的新型混合质谱仪）的PRM（平行反应监测）和MS3靶向检测策略。通过15N标记蛋白标准品，实现了酒精性肝病（ALD）标志物的绝对定量，将标志物发现到临床检测的周期缩短至数天，为蛋白质组学向临床转化提供了高效解决方案。

　　

在临床蛋白质组学领域，生物标志物的发现与验证长期面临"死亡之谷"困境——尽管高通量质谱技术能筛选出大量候选标志物，但传统三重四极杆质谱（triple quadrupole MS）的SRM/MRM（选择/多反应监测）模式仅能检测有限数量的肽段片段，且开发周期长达数月。这种技术瓶颈严重阻碍了蛋白质组学成果向临床诊断的转化，尤其在肝病领域，全球约三分之一人群患有脂肪肝疾病，亟需高特异性检测手段。

德国马普生物化学研究所（Max-Planck Institute of Biochemistry）的Maria Wahle团队与Thermo Fisher科学家合作，在《Molecular 》发表研究，开发了革命性的Stellar MS混合高速质谱平台。该仪器创新性地将三重四极杆的稳定性与线性离子阱（LIT）的全扫描能力结合，通过PRM技术实现每秒70次的高通量检测，并支持MS³级联碎裂。研究人员首次系统评估了该平台在临床转化中的应用价值：从Orbitrap Astral的发现数据中快速转化标志物面板，并创新性采用¹⁵N全蛋白标记策略，建立了酒精性肝病（ALD）的精准检测体系。

关键技术包括：1）基于DIA（数据非依赖采集）的GPF（气相分级）策略构建目标列表；2）PRM Conductor软件实现自动化靶向方法开发；3）¹⁵N标记重组蛋白（SERPINC1等7种肝病相关蛋白）作为内标；4）自适应保留时间对齐（Adaptive RT）技术消除色谱漂移影响；5）MS³与PRM混合采集模式优化灵敏度。研究使用LMU Munich提供的EDTA抗凝血浆样本，通过Evosep One系统进行60 SPD（样本/天）梯度分离。

结果

1. 1.

   仪器原理验证：相比传统三重四极杆（Q3选择单一离子），Stellar MS的LIT可同时累积所有碎片离子（图1），使PRM灵敏度提升N倍（N为碎片离子数），且支持后验碎片离子选择。MS³通过CID/HCD组合实现40Hz扫描，对长肽段检测限（LOD）降低50%。

2. 2.

   标志物面板转化：从Orbitrap Astral DIA数据转化的5,437个前体离子中，60%可在Stellar MS重现（dotp>0.8），CV中位数17.4%。通过机器学习筛选，最终靶向面板覆盖440μg/mL（铜蓝蛋白）至26ng/L（SUMO1激活酶）的动态范围（图4B），85%肽段CV<20%。

3. 3.

   ¹⁵N标记蛋白应用：7种重组蛋白标记效率>99%（图5D）。以甲状腺素运载蛋白（TTR）为例，同步检测未修饰肽段（GSPAINVAVHVFR）与疾病相关修饰位点（AADDTWEPFASGK的E62羧化），证实健康人群修饰位点占有率可忽略（图6D-E）。ITIH4蛋白通过轻重链分别定量，揭示糖基化位点空间分布特征（图6F-H）。

4. 4.

   性能验证：绝对定量显示血浆TTR浓度239.47mg/L（HPA参考值80mg/L），ITIH4轻重链分别达90.87mg/L和210.51mg/L（免疫检测仅0.001-0.006mg/L），凸显质谱对蛋白异质体的分辨优势（表1）。

结论与意义

该研究建立了"发现-验证-临床"的闭环转化范式：Stellar MS的PRM通量（100肽段/分钟）和¹⁵N全蛋白内标策略，将标志物开发周期从数月缩短至数天。其创新性体现在：1）首次实现DIA发现数据向靶向方法的无缝转化；2）¹⁵N蛋白标准品可监控酶解偏差和PTM（如ITIH4糖基化）；3）MS³提升长肽段检测特异性，为低丰度标志物（如AFP）提供新方案。该技术有望替代ELISA，成为多标志物联检的新标准，尤其适用于肝病分期（如FAP相关TTR糖基化分型）和肿瘤早筛。未来通过扩大¹⁵N蛋白库和优化机器学习靶向预测，将进一步推动个性化蛋白质组学进入临床实践。