伤口相关细菌在不同理化条件下自发荧光特性及其对光诊断与光动力治疗的启示

本研究针对伤口感染诊断和治疗中的关键问题，通过系统探究鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌在不同温度、盐度和pH条件下的自发荧光特性，揭示了伤口微环境对细菌内源性卟啉合成的调控机制。研究人员采用荧光成像和光谱分析技术，发现革兰阳性菌主要产生粪卟啉I（coproporphyrin I），而革兰阴性菌主要合成原卟啉IX（protoporphyrin IX），且荧光强度与细菌种类、生长阶段和培养条件显著相关。该研究为优化光诊断（PD）和抗菌光动力治疗（aPDT）参数提供了重要理论依据，对实现伤口感染的精准诊疗具有重要临床意义。

　　

在临床伤口管理中，早期准确识别感染病原体并实施有效治疗始终是重大挑战。传统微生物培养方法耗时长达24-48小时，而基于临床症状的判断特异性不足。与此同时，抗生素耐药性问题日益严峻，亟需发展新型诊疗策略。细菌自发荧光技术因其快速、无创的特点展现出独特优势——特定波长的光激发下，细菌内源性卟啉类物质可产生特征性荧光信号，既可用于光诊断（PD）实现即时检测，又能通过抗菌光动力治疗（aPDT）产生活性氧杀伤病原体。然而，伤口复杂的理化环境如何影响细菌荧光特性，这一关键科学问题尚未得到系统解答。

中国科学院合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所的研究团队在《BMC Microbiology》发表的重要研究中，选取四种常见伤口感染病原体（鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌），创新性地模拟伤口微环境参数梯度，通过多维度实验揭示了温度、盐度和pH对细菌自发荧光特性的调控规律。研究采用标准LB培养基培养细菌，添加5-氨基乙酰丙酸（ALA）促进卟啉合成，建立菌落计数与光密度（OD₆₀₀）的标准曲线。关键技术包括：1）使用MolecuLight i:X荧光成像设备定量红色荧光强度；2）通过OmniFluo990荧光光谱仪获取激发-发射矩阵光谱（EEMs）；3）采用ImageJ软件进行图像分析；4）以粪卟啉I和原卟啉IX为标准品进行光谱比对。

【细菌细胞学与自发荧光随时间变化】

研究发现所有菌种均呈现典型的三阶段荧光动态：快速上升期（T₁-T₂）、平台期和衰退期（T₂-T₃）。值得注意的是，从T₁到T₂阶段，荧光强度增加4.46-5.31倍，远高于菌落直径（1.13-2.09倍）和细菌载量（1.10-3.23倍）的增长幅度，表明荧光增强主要源于代谢活跃期的卟啉合成上调而非单纯生物量积累。

【培养温度的影响】

温度在25-43°C范围内均能诱导荧光产生，但动力学差异显著。37°C时荧光强度达到峰值，且温度每升高1°C，荧光积累速率提高约15%。特别发现43°C时肺炎克雷伯菌出现光谱特征转变，其632nm和701nm峰向622nm和690nm偏移，提示高温可能改变卟啉代谢通路。

【盐度的影响】

1-4% NaCl梯度实验显示，盐度增加导致荧光强度呈剂量依赖性降低。金黄色葡萄球菌虽表现出较强耐盐性（4% NaCl时仍保持34.76 AU），但荧光强度仍降低75%。光谱分析揭示2% NaCl时肺炎克雷伯菌出现589nm峰，可能反映盐应激下金属卟啉的形成。

【pH值的影响】

pH 5-9范围内，中性条件（pH 7）最利于荧光产生。碱性环境（pH≥8）显著抑制所有菌种的荧光，其中金黄色葡萄球菌在pH 9时荧光完全消失。值得注意的是，大肠杆菌在pH 9时出现特征性光谱转变，其632nm峰位移至622nm，表明碱性条件可能诱导其卟啉合成途径从原卟啉IX向粪卟啉I转换。

【发射光谱特征】

通过405nm激发光下的EEMs分析，研究团队建立了细菌荧光指纹图谱：金黄色葡萄球菌始终匹配粪卟啉I标准（622/690nm），鲍曼不动杆菌则符合原卟啉IX特征（632/701nm）。而肺炎克雷伯菌和大肠杆菌表现出条件依赖性转换，培养时间延长或环境优化时，其光谱会从原卟啉IX型向粪卟啉I型转变。

这项研究首次系统阐明了伤口微环境参数与细菌自发荧光的定量关系，具有多重重要意义：首先，为临床荧光成像结果的解读提供了科学依据——急性伤口常见的酸性环境和局部高温可能增强荧光信号，而慢性伤口的碱性状态可能导致假阴性。其次，发现肺炎克雷伯菌等革兰阴性菌存在卟啉代谢可塑性，提示需要根据感染菌种和环境调整aPDT的光源参数。最后，研究提出的"荧光强度-光谱特征"双参数分析法，为发展智能化的伤口感染分级诊断系统奠定了理论基础。未来研究可进一步探索生物膜状态下的荧光特性，以及如何通过微环境调控增强光动力治疗效果，推动精准医疗在伤口管理领域的应用。