基于细胞荧光报告系统的高通量筛选技术开发ATE1小分子抑制剂及其在神经退行性疾病中的治疗潜力

本研究针对精氨酰转移酶1（ATE1）缺乏选择性抑制剂的难题，开发了基于DD-β15-mCherry/GFP双荧光报告系统的细胞水平高通量筛选（HTS）平台。通过1536孔板验证和LOPAC?1280库筛选，建立Z'因子达0.86的稳健方法，发现8个IC50≤10 μM的活性化合物，虽经反筛选排除特异性抑制剂，但为ATE1靶向药物开发奠定关键技术基础。

　　

在蛋白质翻译后修饰领域，精氨酰转移酶1（Arginyltransferase 1, ATE1）介导的精氨酰化（arginylation）过程长期被视为细胞应激反应的"分子开关"。这种修饰通过在蛋白质N端添加精氨酸残基，像"死亡标签"一样标记靶蛋白使其被蛋白酶体降解。近年研究发现，ATE1活性异常升高与脊髓损伤后的神经元死亡、癌症转移和慢性炎症密切相关，尤其在急性应激状态下，过度激活的ATE1会像"多米诺骨牌"触发连锁性细胞死亡。然而令人惊讶的是，这个发现已逾二十年的关键酶，至今仍未有FDA批准的选择性小分子抑制剂——现有化合物如亚砷酸盐、汞溴红等要么毒性过高，要么像"散弹枪"般缺乏靶向性。

美国斯克里普斯研究所（The Herbert Wertheim UF Scripps Institute for Biomedical Innovation and Technology）的Claudia McCown团队在《SLAS Discovery》发表的研究，如同为这个"无药可靶"的难题投下一束曙光。研究人员巧妙设计"分子诱饵"——将ATE1的天然底物β-肌动蛋白N端15肽（DD-β15）与mCherry红色荧光蛋白融合，并引入GFP作为内参，构建出"降解指示器"。当ATE1给DD-β15打上精氨酰化标签时，整个融合蛋白会被细胞"垃圾处理厂"蛋白酶体迅速分解，导致红绿荧光比值降低；而ATE1抑制剂则能像"保护罩"一样维持mCherry信号。这种双信号校正策略有效克服了传统体外酶学方法无法评估细胞渗透性和毒性的缺陷。

关键技术突破体现在三大维度：首先建立四重细胞模型体系，包括野生型ATE1的DD-β15报告细胞、模拟非精氨酰化的M-DD-β15突变体、模拟持续精氨酰化的R-DD-β15突变体以及ATE1敲除细胞，形成严密的"反筛选防火墙"；其次优化1536孔板检测参数，使1% Triton X-100裂解条件下的Z'因子达到0.86，信号背景比达3.61；最后开发自动化流程，单孔仅需3μL体系即可完成从化合物处理到荧光检测的全流程。

研究结果部分揭示多项重要发现：

1. 1.

   荧光报告系统验证

   通过Western blot证实DD-β15-mCherry在野生型细胞中的半衰期比ATE1敲除细胞短3倍，证明降解依赖ATE1活性。蛋白酶体抑制剂MG132处理使mCherry/GFP比值升高2.9倍，IC₅₀为2.88 μM，验证通路敏感性。

2. 2.

   微型化工艺优化

   发现甲醛固定会因蛋白交联产生假阳性信号，确定0.5% Triton X-100裂解后2小时内检测的稳定性。DMSO耐受测试显示0.75%浓度不影响信号，为化合物库筛选扫清障碍。

3. 3.

   LOPAC库筛选

   1280种化合物初筛产生16个hit化合物（1.25% hit率），其中8个显示剂量依赖性抑制。但反筛选显示所有化合物在ATE1-KO细胞中均保持活性，提示其通过非特异性机制（如蛋白酶体抑制或荧光干扰）发挥作用。

4. 4.

   荧光干扰排除

   发现62.5%的活性化合物存在自发荧光，如原卟啉IX在mCherry通道的信号超出对照1414倍，凸显荧光检测需配合正交验证。

讨论部分尖锐指出，尽管未发现真正ATE1特异性抑制剂，但该研究像"分子探照灯"般照亮了后续开发路径：其一，建立的首个细胞水平ATE1-HTS平台突破传统体外酶学对纯化蛋白和tRNA的依赖；其二，设计的"三锁反筛选"体系（M-DD15/R-DD15/ATE1-KO）可有效过滤90%以上的假阳性；其三，揭示现有化合物库中多数活性成分通过"劫持"蛋白酶体或产生荧光干扰的"障眼法"发挥作用。这些发现为针对神经损伤和退行性疾病的ATE1靶向药物开发铺设了关键技术轨道，未来结合DNA编码库或片段筛选策略，有望破解这个困扰学界二十年的靶点困局。