谷氨酸棒杆菌中无膜细胞器的工程化构建及其在增强靛蓝苷生物合成与抗菌肽生产中的应用

本研究针对微生物细胞工厂中代谢效率低和产物毒性两大难题，创新性地在工业菌株谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中构建了液-液相分离（LLPS）驱动的无膜细胞器（MLOs）。研究人员利用秀丽隐杆线虫LAF-1蛋白的RGG结构域，优化了蛋白凝聚体形成条件，成功将MLOs技术应用于靛蓝苷生物合成途径（产量提升2.43倍）和毒性抗菌肽（AMPs）表达（实现melittin和lactoferricin B的可溶性表达）。该研究为工业微生物的代谢工程提供了全新策略，拓展了LLPS系统在生物制造中的应用边界。

　　

在合成生物学领域，微生物细胞工厂常面临两大"阿喀琉斯之踵"：目标产物产量低下和代谢中间体毒性。传统解决方案如启动子优化或培养条件调整已接近瓶颈，而近年兴起的液-液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS）技术为这一困局带来了曙光。这种通过弱相互作用力形成动态无膜细胞器（Membraneless Organelles, MLOs）的现象，能像细胞内的"微型反应釜"般浓缩酶与底物，但此前从未在氨基酸生产主力军——谷氨酸棒杆菌中实现。

中国科学院合肥物质科学研究院强磁场科学中心的研究团队在《Techniques and Innovations in Gastrointestinal Endoscopy》发表突破性成果。他们巧妙借用秀丽隐杆线虫LAF-1蛋白的RGG结构域（一种富含精氨酸-甘氨酸重复序列的内在无序区域），首次在谷氨酸棒杆菌中构建了功能性MLOs。通过荧光蛋白标记、尿素扰动实验和荧光漂白恢复（FRAP）技术，证实这些蛋白凝聚体具有典型液体特性，能在1 μM低浓度下自发组装，且荧光恢复率达65%。

研究团队采用三重技术路线验证MLOs的实用价值：首先以靛蓝苷为代谢模型，将合成酶bpsA与RGG融合后，产量飙升至3.45 g/L（提升2.43倍），1,6-己二醇处理实验证实该效应依赖LLPS机制；继而挑战抗菌肽表达难题，成功使剧毒的melittin和lactoferricin B在MLOs"保护罩"下实现可溶性表达，Western blot显示清晰条带，而对照组因细胞毒性无法检测到表达；最后通过4% 1,6-己二醇破坏相分离，使AMPs表达量下降37-54%，反向验证了MLOs的毒素屏蔽作用。

设计并验证谷氨酸棒杆菌中的无膜区室

通过AIUPred预测和EGFP标记，证实单个RGG结构域即可驱动相分离，形成极性定位的蛋白凝聚体，SDS-PAGE显示存在约38 kDa降解片段。

表征RGG介导的无膜区室特性

优化发现6小时预培养+0.2 mM IPTG诱导+25°C培养为最佳条件，体外实验显示NaCl>400 mM会抑制相分离，FRAP分析证实其动态交换特性。

相分离区室化空间组织靛蓝苷生物合成途径

RGG-bpsA融合使靛蓝苷产量突破性增长，1,6-己二醇处理使产量骤降55.65%，证明MLOs通过提升酶局部浓度增强代谢流。

无膜细胞器介导的毒素屏蔽增强AMPs生产

RGG融合使melittin和lactoferricin B表达量从检测限以下提升至明显条带，细胞生长曲线证实毒性缓解，相分离破坏后OD₆₀₀下降22.1-25.4%。

这项研究不仅填补了MLOs技术在工业菌株中的应用空白，更开创了"相分离装甲"保护毒性蛋白表达的新范式。值得注意的是，谷氨酸棒杆菌中单个RGG结构域即可有效驱动相分离，这与大肠杆菌等模式菌需多拷贝RGG的特性形成鲜明对比，暗示不同微生物的胞内环境对LLPS存在特异性调控。未来通过引入光敏模块或共定位代谢通路酶，有望实现MLOs的精准时空控制，为生物制造提供"智能细胞车间"。该成果为高附加值化合物生产和高毒性蛋白表达提供了普适性解决方案，标志着合成生物学进入"相分离编程"新阶段。