高通量解析细胞周期蛋白对接互作揭示线性短肽结合决定因素的复杂性

本研究针对细胞周期调控中短线性基序(SLiMs)介导的蛋白互作机制展开深入探索。研究人员通过开发系统性细胞内基序结合分析(SIMBA)技术，结合冷冻电镜和饱和突变扫描，系统鉴定了11种人类细胞周期蛋白(cyclin D/E/A/B/F)与约10万种肽段的结合特性。研究发现细胞周期蛋白可识别多种非经典对接基序，揭示了基序识别、结合强度及周期蛋白选择性的分子决定因素，为理解CDK磷酸化时序调控提供了新框架。

　　

细胞周期调控是生命科学的核心问题之一，其精确性直接影响细胞增殖、发育和疾病发生。在真核细胞中，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)通过磷酸化数百种底物蛋白来协调DNA复制、染色体分离等关键事件。然而，这些磷酸化事件如何实现精确的时序控制？传统观点认为细胞周期蛋白(cyclin)通过识别底物中的短线性基序(SLiMs)来介导特异性招募，但人们对这些基序的多样性、结合强度梯度以及特异性决定因素仍知之甚少。

来自瑞士巴塞尔大学(Biozentrum, University of Basel)等机构的研究团队在《Nature Communications》发表重要成果。研究人员开发了创新的系统性细胞内基序结合分析(SIMBA)平台，结合冷冻电镜和深度突变扫描，系统解析了人类5大类11种细胞周期蛋白的基序识别规律。研究发现细胞周期蛋白可识别远比预期更丰富的基序类型，包括三类RxL基序和多种非经典变体，这些发现重塑了人们对CDK底物招募机制的理解。

关键技术包括：(1)开发SIMBA酵母报告系统定量检测10万种肽段与11种cyclin的细胞内结合；(2)构建覆盖808个细胞周期相关蛋白的16肽平铺文库；(3)采用深度突变扫描解析51个基序的序列决定因素；(4)通过冷冻电镜解析非经典基序的结合模式；(5)建立CDK活性报告系统验证基序特异性对磷酸化时序的影响。

结果部分

SIMBA技术实现细胞周期蛋白结合肽段鉴定

研究人员将酵母交配通路重编程为定量报告系统，当外源cyclin与Ste20^ScPM中插入的基序结合时，会抑制生长停滞信号。验证表明该系统能特异性检测人cyclin与RxL/LP基序的互作，且突变疏水斑块(hydrophobic patch)会消除结合。

定量筛选揭示结合基序的多样性

通过平铺808个细胞周期相关蛋白的约9万种16肽，鉴定出100余个新结合基序。典型如RBL1中的RxL基序呈现周期性结合峰，而MASTL中的非经典基序KNLMCEL虽缺乏Φ_C疏水残基仍能结合cyclin B1。

RxL基序展现差异亲和力与特异性

比较51个RxL基序发现：病毒蛋白基序普遍高亲和力；人类基序可分为泛cyclin(如INSM1)、部分选择性(如p21仅结合D/E/A)和特异性(如MASTL仅结合B类)三类。荧光偏振实验验证SIMBA评分与体外亲和力高度相关。

结合决定因素与意外结合模式

深度突变扫描将RxL基序分为三类：Φ_C在P+1(1型)、P+2(2型)或P+4(3型)。冷冻电镜显示GMNC的3型基序(RNLSSEF)通过α螺旋使P+4苯丙氨酸嵌入疏水口袋。序列背景分析表明，仅15%符合严格RxL共识的肽段实际具有结合活性，凸显非核心位点的重要性。

非经典基序的识别机制

发现多种突破经典共识的基序：(1)SAMHD1的VxLF基序通过P-5/P-3碱性残基替代P-2精氨酸；(2)PKN2的QxLxF基序依赖P-4缬氨酸实现cyclin B1特异性；(3)DOT1L的RxLxF基序证明异亮氨酸可替代P0亮氨酸。冷冻电镜揭示这些变体通过重构结合界面维持相互作用。

基序特异性调控细胞周期时序

构建CDK报告系统显示：泛cyclin基序驱动持续磷酸化；cyclin A特异性基序(如ORC1)导致S期陡增；cyclin B特异性基序(如BRCA2 K-3E)仅在晚期激活。这证实基序特异性是时序调控的关键决定因素。

这项研究通过百万级定量互作测量，重新定义了细胞周期蛋白的基序识别规则。发现的基序多样性(从严格RxL到多种变体)和特异性梯度(从泛cyclin到高度选择性)为理解CDK底物选择提供了分子基础。特别值得注意的是，非核心位点的协同作用解释了为何多数RxL共识匹配不具功能性，而构象灵活性(如3型α螺旋)拓展了结合模式的范围。这些发现不仅对细胞周期领域有深远影响，也为更广泛研究SLiM介导的蛋白互作网络提供了范式。技术层面，SIMBA平台的高通量特性与冷冻电镜的结构解析形成完美互补，这种组合策略可推广至其他蛋白互作系统研究。鉴于CDK在癌症等疾病中的核心地位，这些基序识别规律的解析将为靶向药物设计提供新思路。