综述：动物寄生线虫分子工具研究进展——从遗传标记到宏条形码与基因组学

这篇综述系统回顾了动物寄生线虫分子检测技术的演进历程，从基于核糖体ITS-1/ITS-2标记的PCR技术，到高通量宏条形码（metabarcoding）和基因组学（genomics）方法，重点阐述了"线虫组学"（nemabiome）框架在物种鉴定、隐存种发现及流行病学监测中的应用，为寄生虫病防控提供了分子技术路线图。

　　

动物寄生线虫分子工具研究进展

内部转录间隔区作为分子标记

核糖体DNA的内转录间隔区（ITS-1/ITS-2）因其高度变异性成为线虫鉴定的黄金标准。NC1-NC2引物对在圆线虫目（Strongylida）中展现出卓越特异性，可扩增250-450bp片段，实现单卵水平检测。这些非编码区通过保守二级结构指导rRNA成熟，其种内保守性与种间变异性平衡的特性，使其成为区分近缘种的理想靶标。

分类学研究工具

PCR-RFLP和SSCP等早期技术已发展为实时荧光定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）。针对捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）、奥氏奥斯特线虫（Ostertagia ostertagi）等畜牧病原体，多重PCR体系可同时检测8-10个物种，灵敏度达1-10个虫卵/克粪便。

系统发育研究突破

ITS序列解决了传统形态学无法判定的进化关系，例如揭示环纹奥斯特线虫（Teladorsagia circumcincta）复合种包含3个隐存种。线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（cox-1）基因的引入，为种群遗传学研究提供了母系遗传标记。

诊断与流行病学应用

在土壤传播蠕虫（STHs）监测中，基于ITS-2的检测方法将美洲钩虫（Necator americanus）与十二指肠钩虫（Ancylostoma duodenale）的鉴别时间从数周缩短至8小时。大规模筛查显示，混合感染率比传统镜检高37%。

线虫组学技术

Illumina平台高通量测序结合NC1-NC2引物，单次运行可解析2000份样本的群落结构。在反刍动物寄生线虫研究中，该技术发现传统培养法漏检的Cooperia spp.占比达15%。

线粒体与核基因组进展

PacBio长读长测序解决了线粒体基因组非编码区组装难题，已完成50余种寄生线虫全长线粒体图谱。牛津纳米孔技术（ONT）实现田间样本实时测序，绦虫线虫（Trichostrongylus）全基因组测序成本降至200美元/样本。

技术前景展望

CRISPR-Cas9富集技术可无扩增检测pg级DNA，结合微流控芯片使检测通量提升100倍。第三代测序的端粒到端粒（T2T）组装将推动比较基因组学研究，为抗药性标记挖掘提供新途径。

方法论挑战

需建立标准化生物信息学流程解决：①引物交叉反应（如NC2引物对蛔虫科扩增效率降低）；②嵌合体序列（发生率约1.2%）；③数据库覆盖度（现有参考序列仅涵盖已知物种的63%）。

跨学科整合方向

地理信息系统（GIS）与线虫组学数据融合，成功预测澳大利亚绵羊捻转血矛线虫苯并咪唑抗药性传播热点，准确率达89%。这类整合策略将为One Health框架下人畜共患线虫病的防控提供新范式。