新型多位点序列分型方案的设计与验证：提升人畜共患病原体微小隐孢子虫的分子溯源能力

研究人员针对微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)现有分子分型方法(gp60)分辨率不足的问题，开发了基于全基因组数据(WGS)筛选的8个SNP标记的多位点序列分型(MLST)方案。该研究分析了欧洲13国440例样本，鉴定出154种MLST型别，Hunter-Gaston分辨指数达0.98，显著优于传统gp60分型(0.85)，为追踪人畜共患传播链提供了新工具。

　　

隐孢子虫病是全球范围内重要的人畜共患寄生虫病，其中微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是导致人类和幼龄反刍动物腹泻的主要病原体。尽管60kDa糖蛋白基因(gp60)分型长期作为标准方法，但其分辨率有限且易受重组事件干扰，难以区分暴发集群与散发案例。更棘手的是，欧洲流行的常见gp60亚型(如IIaA15G2R1)在人类和动物中广泛分布，使得追踪具体传播链变得困难。

针对这一技术瓶颈，瑞典兽医局(Swedish Veterinary Agency, Uppsala)联合欧洲多国研究团队开展了一项创新性研究。研究人员通过分析135例欧洲人源和反刍动物源微小隐孢子虫的全基因组数据(WGS)，开发出基于单核苷酸多态性(SNP)的新型多位点序列分型(MLST)方案，相关成果发表在《Current Research in Parasitology》期刊。

研究采用三大关键技术：首先运用生物信息学流程从43例人源和92例反刍动物源WGS数据中筛选高变编码区；其次通过实验室验证从18个候选标记中优化出8个染色体特异性SNP标记；最后对欧洲13国305例野外样本(人类98例，牛191例，羊12例，山羊4例)进行嵌套PCR和双向Sanger测序。

研究结果揭示：

1. 1.

   标记筛选：比较基因组分析发现150个候选片段，经引物设计可行性评估保留69个，最终选定8个染色体特异性标记，其中4号染色体标记CPATCC_0021750含SKSR氨基酸重复基序且变异最大(21个等位基因)。

2. 2.

   分辨效能：在365例完整分型样本中鉴定出154种MLST型别，105种为单一型，常见型MLST-1跨9国分布于31例人畜样本中。8标记组合的Hunter-Gaston分辨指数达0.98，显著高于gp60单基因分型(0.85)。

3. 3.

   暴发调查：英国暴发样本中，5例关联病例呈现相同MLST-14型，但另一起暴发的3例样本却因2号染色体标记差异被分为3种MLST型，显示该方法可能过度区分流行病学关联样本。

4. 4.

   混合感染：22例样本(主要为丹麦牛源)显示混合测序图谱，其中17例发生在2号染色体标记CPATCC_0028230位点，提示该区域可能更易发生基因组重组。

讨论部分指出，该MLST方案虽然实现了0.98的高分辨力，但存在操作复杂(需8重嵌套PCR)、部分标记变异不足等局限性。值得注意的是，研究首次证实欧洲流行的gp60亚型IIaA15G2R1可被细分为46种MLST型，而相同MLST型(如MLST-2)可能对应11种不同gp60亚型，凸显了多基因联合分析的优越性。

这项研究为微小隐孢子虫分子流行病学研究提供了新范式。未来可通过整合SNP与VNTR标记，或采用扩增子测序技术同时分析更多位点，以平衡分辨力与实用性。正如通讯作者Simone M. Cacciò强调的，全基因组测序仍是金标准，但随着测序成本降低和生物信息学流程优化，WGS有望成为常规监测工具，为揭示隐孢子虫传播网络提供终极解决方案。