工程化亚磷酸盐生态位促进合成土壤菌群中Pseudomonas veronii的定殖与甲苯降解研究

本研究创新性地利用亚磷酸盐（Phi）作为选择性营养源，通过基因工程改造甲苯降解菌Pseudomonas veronii 1YdBTEX2（携带ptxD基因），在合成土壤微生物群落（SynCom）中构建专属生态位。实验证明Phi可使接种菌丰度提升6倍，并加速甲苯（BTEX污染物）清除，为土壤生物修复提供了精准调控微生物竞争的新策略。

　　

亚磷酸盐作为合成土壤菌群中Pseudomonas veronii的工程化生态位

ABSTRACT

生物强化（Bioaugmentation）是通过引入污染物降解微生物修复土壤的有效手段，但其应用受限于接种菌在土著菌群中的定殖能力。研究团队以芳香烃污染物甲苯（BTEX）为靶标，通过向甲苯降解菌Pseudomonas veronii 1YdBTEX2基因组中插入亚磷酸盐脱氢酶基因（ptxD），构建了能同时利用亚磷酸盐（Phi）和甲苯的工程菌株。在合成土壤菌群（SynCom）模型中，Phi的添加使工程菌丰度提升6倍，且甲苯降解速率显著加快。值得注意的是，Phi的选择性优势在碳受限环境下与甲苯代谢未呈现叠加效应，而接种菌衰减后菌群多样性可恢复至初始状态。

INTRODUCTION

土壤污染尤其是BTEX类物质对人类健康和生态安全构成严重威胁。传统生物修复面临的核心挑战是接种菌因营养竞争难以在复杂菌群中存活。研究提出利用Phi——一种需ptxD或碱性磷酸酶（phoV）转化的非生物可利用磷源——作为选择性营养策略。Phi在土壤中流动性优于磷酸盐（Pi），且WM88菌株（现归类为Stutzerimonas）已证实其植物毒性及微生物转化潜力。

RESULTS

Phi-oxidizing capacity of P. veronii ptxD⁺

通过菌落PCR验证重组菌株ptxD基因插入成功。在21C培养基中，野生型（WT）仅能在Pi中生长，而ptxD⁺工程菌在Phi培养基中表现出特异性增殖能力。

Phosphite as a selective nutritional niche

在生长阶段（Growth phase）的土壤微宇宙中，SynCom总菌量达10⁸–10⁹ CFU/g，而Phi的添加使工程菌在SynCom背景下丰度提升6倍（P=0.035）。稳定阶段（Stable phase）中，Phi仍使工程菌保持50-100倍更高丰度（P=0.048）。NMDS分析显示Phi显著改变菌群结构（P=0.004）。

SynCom growth and toluene response

甲苯作为载体溶剂HMN的溶质（130 μg/g土壤）被安全递送。工程菌在甲苯污染土壤中单独培养时增殖50倍，且甲苯清除率显著高于无菌对照（P=0.02）。值得注意的是，SynCom暴露于甲苯时，虽总体菌量不变，但α多样性显著降低（P=4.83×10^–8）。

Toluene removal by P. veronii ptxD⁺

甲苯与Phi联用时，工程菌在生长阶段第21天丰度出现3倍提升（P=0.019），但甲苯降解速率未进一步加快。液体土壤提取物（SE）实验中，Phi使工程菌24小时丰度提升3倍（P=9.1×10^–5），对应甲苯清除动力学常数从0.04 h^–1提升至0.06 h^–1。

Phi oxidation by SynCom members

基因组分析发现Chitinophaga、Luteibacter等菌株携带phoV碱性磷酸酶基因，可能在Phi转化中起重要作用。这些菌在Phi处理组中显著富集，暗示土壤菌群存在替代性Phi代谢途径。

DISCUSSION

该研究首次在土壤菌群中验证ptxD选择系统的有效性。在碳受限环境中，甲苯作为选择性碳源的优势强于Phi的磷源优势，反映土壤微宇宙模型的磷限制程度可能低于实际污染场地。工程菌代谢甲苯时存在碳泄漏现象，约5.9×10^–5 g_C/g_soil的甲苯碳流向其他菌群成员，印证了微生物交叉喂养（cross-feeding）效应。研究还发现phoV等替代性Phi氧化途径可能影响工程菌的竞争动态，为后续生物修复设计提供重要参考。

MATERIALS AND METHODS

实验采用瑞士洛桑采集的河岸沉积物制备无菌土壤基质（SM），通过21株分离菌构建SynCom。工程菌通过M9培养基（含庆大霉素20 μg/mL）培养，以10⁵ CFU/g接种量加入微宇宙。甲苯浓度通过顶空固相微萃取（HS-SPME）结合GC-MS检测，菌群动态通过16S rRNA基因扩增子测序解析。