牦牛肠道微生物组的培养与基因组解析：揭示极端环境适应的功能潜力与资源挖掘

本研究通过创新性单细菌培养技术结合多组学分析，成功构建包含548个高质量基因组的牦牛粪便细菌参考集（YFR），其中216株为潜在新物种，将反刍动物肠道可培养菌种比例提升19.39%。研究系统揭示了高原牦牛肠道菌群在复杂多糖降解（CAZymes）、新型生物合成基因簇（BGCs）和噬菌体-宿主互作等方面的独特功能适应机制，为极端环境微生物资源开发及合成生物学应用提供重要基础。

　　

ABSTRACT

作为高原极端环境的代表性物种，牦牛依赖肠道微生物群维持关键生理功能。本研究通过整合创新培养策略与基因组测序技术，建立了首个系统的牦牛粪便细菌基因组参考集（YFR），包含548个高质量基因组，其中216株代表4个门、14个属的29个新物种级类群。YFR将反刍动物肠道可培养细菌物种比例提升19.39%，显著扩展了这一生态系统的参考数据库。

INTRODUCTION

动物肠道微生物组蕴含巨大分类多样性，但来自宿主的培养分离株和完整基因组仍然稀缺。本研究聚焦青藏高原牦牛粪便样本，采用四种培养基在需氧和厌氧条件下培养，最终获得1,192株细菌分离株。与Hungate1000项目等现有数据库相比，YFR新增20个新属，使变形菌门（Pseudomonadota）、厚壁菌门（Bacillota）和放线菌门（Actinomycetota）的可培养基因组分别增加3.38倍、3.71倍和5.03倍。

MATERIALS AND METHODS

样本采集自青藏高原纳木错地区16头放牧牦牛的新鲜粪便，采用自主研发的微生物保存液在4°C条件下24小时内转运至实验室。通过10^-1至10^-7梯度稀释，在需氧（37°C）和厌氧（90% N₂、5% CO₂、5% H₂）条件下培养3-4天。基因组组装采用CheckM评估质量（完整性>90%，污染<5%），GTDB-Tk进行物种注释，dRep以95%平均核苷酸一致性（ANI）进行聚类。

RESULTS

Reference genomes of cultivated bacteria

YFR包含基因组大小2-7.9 Mb的548个高质量基因组，GC含量26.6%-74.4%。其中50.19%属于厚壁菌门，29.38%为放线菌门。值得注意的是，Streptococcus vicugnae占新鉴定分离株的50%以上。

Augmenting cultural diversity

与388个牦牛肠道宏基因组样本比较显示，YFR中66个物种在宏基因组中均有代表，其中33个优势物种包含408株菌（190株潜在新菌）。与Hungate1000项目相比，YFR新增70个独有物种级类群。

BGCs with novel potential

预测获得2,607个生物合成基因簇（BGCs），平均每个基因组含4.83个BGCs。RiPPs类BGCs多样性最高（850个），分布在6个门中。值得注意的是，Streptomyces globisporus_A的7.9 Mb基因组携带37个BGCs，其中13个与MIBiG数据库中已验证的抗生素合成簇高度相似。

Polysaccharide digestion capacity

鉴定61,679个碳水化合物活性酶（CAZymes），主要针对几丁质、肽聚糖和木聚糖降解。11个物种含有>50个CAZyme基因簇（CGCs），其中Paenibacillus和Pristimantibacillus属的需氧菌展现出显著的纤维素降解潜力。碳源利用实验证实，50株测试菌中多株能高效降解阿拉伯半乳聚糖和果胶。

Bacteriophage interactions

从323株菌中预测2,224个病毒基因组，包括80个完整噬菌体。聚类形成67个病毒簇（VCs），其中55个为多噬菌体簇。大肠杆菌（Escherichia coli）是主要宿主，携带ARGs和毒力因子（VFs）的VCs多与其相关。

Functional integration of viral genomes

在Streptococcus cluster 53的39株菌中，病毒基因组占宿主基因组0.13%-10.28%，其基因显著富集于抗菌肽抵抗、ABC转运等通路。值得注意的是，病毒基因的存在使同种菌株的功能差异减小，提示其可能促进宿主功能趋同。

DISCUSSION

本研究建立的YFR资源库不仅揭示了高原动物肠道微生物的独特适应策略——如紫外线修复基因（pdg1）和氧化应激响应基因（oxyR）的富集，更发现了Paenibacillus等属菌株合成抗生素和抗肿瘤物质的巨大潜力。需氧型Paenibacillus在多糖降解方面的突出表现，为工业酶开发提供了新思路。

Limitations and future perspectives

当前研究的样本地理范围和时间维度存在局限，未来需结合宏转录组和悉生动物模型，深入验证CGCs功能及其在高原适应中的具体作用机制。