小规模连续病毒过滤模型的开发：内联加标与混合技术的创新应用

《Biotechnology and Bioengineering》：Development of a Small-Scale Continuous Virus Filtration Model That Incorporates Inline Spiking and Mixing

本文创新性地开发了一种整合内联加标(inline spiking)和混合技术的小规模连续病毒过滤(VF)模型，为生物制药从传统批次处理向连续加工转型提供了关键验证策略。研究通过72小时持续运行验证了该系统在稳定病毒水平、蛋白质和缓冲液浓度方面的可靠性，并证实Planova BioEX过滤器对猪细小病毒(PPV)的清除能力达到对数减少值(LRV)>5.5，为连续生物加工中的病毒清除验证建立了标准化方法。

　　

ABSTRACT

生物制造领域正经历从传统批次处理向连续加工的转型，这种转变有望显著提升生产效率和产品质量。然而，连续加工中病毒过滤(VF)验证方法的缺失成为实施障碍。本研究通过开发内联病毒加标和混合的小规模模型，实现了长达72小时的稳定运行，为连续色谱与VF系统提供了创新验证策略。

1 Introduction

生物制造近年来通过连续生物加工技术追求更高效率，但下游纯化特别是病毒过滤步骤的连续化仍面临挑战。传统批次处理采用预过滤和恒定压力模式，而连续VF需要解决色谱输出波动、系统压力控制等关键问题。前人研究虽探索过内联加标技术，但持续时间短或存在混合不均等问题。本研究旨在建立更完整的连续下游处理模型，连接流穿式色谱与VF步骤，通过静态内联混合器确保病毒稳定分布。

2 Materials and Methods

2.1 病毒去除过滤器

采用Asahi Kasei公司的Planova BioEX过滤器（0.001和0.0003 m²有效表面积），配合Thermo Fisher的0.2 μm PES预过滤器。

2.2 蛋白质与缓冲液

使用Sigma Aldrich的牛血清白蛋白(BSA)及PBS缓冲液，以及CHO细胞表达的10 g/L单克隆抗体(mAb)浓缩液（20 mM Tris-乙酸缓冲液，pH 6.5）。

2.3 病毒与感染性检测

选用猪细小病毒(PPV)作为模式病毒，通过TCID₅₀方法测定病毒滴度，采用Spearman-Karber法计算对数减少值(LRV)。

2.4 设备配置

创新性地组合了Masterflex蠕动泵、KD Scientific注射泵和Koflo静态混合器。AKTA Pure 25系统驱动Cellufine MAX色谱柱与病毒过滤器连接，通过压力传感器实时监控。

2.5 内联混合评估

在1-10 g/L BSA浓度及极端pH/电导率条件下验证混合效果。结果显示所有条件下PPV滴度保持稳定（表3、4），证实了系统在48-72小时内的可靠性。

2.6 连续色谱与病毒过滤

建立0.001 m²过滤器处理BSA和0.0003 m²处理mAb的流程（表2）。AKTA系统维持流速0.3 mL/min，压力始终低于0.3 MPa限制值。

3 Results and Discussion

3.1 蛋白浓度与缓冲液组成影响

数据显示（表3），1-10 g/L BSA溶液中PPV滴度在48小时内保持稳定，波动在可接受范围内。极端缓冲条件下（表4），72小时运行仍保持滴度稳定，验证了系统鲁棒性。

3.2 连续色谱-VF系统

压力曲线显示（图2），BSA过滤压力从10 psi升至15 psi，mAb处理从13-15 psi升至25-27 psi，均远低于安全阈值。关键的是，所有运行均实现PPV完全清除，LRV≥5.5（表5，图3）。

3.2.1 病毒清除效能

BSA运行获得LRV≥5.7，两批次mAb运行分别达到LRV≥5.5和≥5.7。值得注意的是，色谱纯化步骤显著降低了压力上升速率，提示其对蛋白聚集体的去除作用。

4 Conclusion

本研究成功建立了连接色谱与VF的连续处理小规模模型，通过内联加标技术实现了72小时稳定运行。Planova BioEX过滤器展现出卓越的病毒清除能力，为连续生物加工的病毒验证提供了标准化方案。未来需在结合-洗脱模式色谱等更复杂条件下进一步验证该系统的适用性。