基于化学衍生化-UHPLC-MS/MS技术的人血浆中多种肠道菌群代谢物的精准检测方法

本研究针对肠道菌群代谢物（SCFAs、pCS、INDS等）在生物基质中检测的挑战，开发了结合3-NPH衍生化的UHPLC-MS/MS方法，可同步定量7种代谢物，灵敏度达0.4-8 μM，准确度87-114%，BAGI评分65。该方法为肠道-宿主互作机制研究提供了高效分析工具，助力疾病生物标志物探索。

　　

肠道微生物被称为人类的"第二基因组"，其代谢产物如短链脂肪酸(SCFAs)、吲哚衍生物等，在维持宿主健康中扮演关键角色。这些代谢物不仅是肠道菌群与宿主"对话"的化学语言，更与慢性肾病、神经精神疾病等多种疾病密切相关。然而，由于这些分子具有浓度低、结构多样、基质干扰大等特点，传统检测方法往往面临灵敏度不足、通量有限等挑战，难以实现多组分同步精准分析。

针对这一技术瓶颈，葡萄牙波尔图大学药学院化学科学系LAQV/REQUIMTE研究中心的研究团队开发了一种创新分析方法。通过将3-硝基苯肼(3-NPH)化学衍生化与超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UHPLC-MS/MS)技术相结合，成功实现了人血浆中7种关键肠道代谢物的同步检测，相关成果发表在《The Journal of Climate Change and Health》上。

研究团队主要采用三大技术策略：首先优化3-NPH衍生化条件，确定200 mM 3-NPH与120 mM EDC在25℃反应30分钟的最佳参数；其次建立BEH C18色谱柱分离方法，采用甲酸-水/乙腈梯度洗脱；最后开发负离子模式下的多反应监测(MRM)检测方案，通过特征碎片离子实现高特异性分析。研究特别纳入来自儿童ADHD研究(M2Child)和成人微生物组研究(Microbi-A)的临床样本进行方法验证。

方法开发部分显示，通过系统优化色谱梯度程序（初始15%乙腈保持0.5分钟），成功将7种代谢物的分析时间缩短至18.5分钟。质谱检测中，衍生化SCFAs产生特征性m/z 137（3-硝?苯胺阴离子）和m/z 152碎片，而pCS和INDS则通过中性丢失80 Da（-SO₃）进行鉴定。方法验证结果表明，所有分析物在生理浓度范围内线性良好（r²>0.997），LLOQ达0.4-8 μM，准确度87.0-114%，日内精密度≤13.5%。

在临床样本分析中，该方法成功检测到健康儿童与ADHD患儿、健康成人血浆中的代谢差异。数据显示，乙酸(AA)浓度最高（37.1-120 μM），其次为对甲酚硫酸盐(pCS, 4.9-182 μM)和色氨酸(TRP, 31-64 μM），而丙酸(PA)、丁酸(BA)和吲哚-3-乙酸(IAA)浓度普遍较低。值得注意的是，7/10样本中BA浓度低于1 μM的定量限，这可能与其在血浆中的快速代谢特性有关。

这项研究的创新性在于首次实现了SCFAs与芳香族氨基酸代谢物（pCS、INDS等）的同步检测，突破了传统方法只能分析单一类别代谢物的局限。通过BAGI适用性评估体系（得分65）证实，该方法兼具高灵敏度与操作可行性，特别适合临床大队列研究。该技术不仅为探索肠道-脑轴等前沿科学问题提供了有力工具，更为代谢性疾病、精神障碍等疾病的机制研究开辟了新途径。未来通过进一步优化衍生化程序，该方法有望扩展至尿液等其他生物基质分析，构建更全面的肠道代谢组学检测平台。