金吉罗鱼早期发育阶段免疫基因表达研究中内参基因的筛选与验证

本研究针对濒危鲤科鱼类金吉罗鱼(Tor putitora)早期发育阶段缺乏稳定内参基因的问题，研究人员通过评估18S、rpn1、actb等6个候选基因的表达稳定性，采用geNorm、NormFinder等5种算法综合分析，最终确定β-肌动蛋白(actb)为最稳定内参基因。该研究为金吉罗鱼发育生物学和免疫机制研究提供了关键标准化工具，对提高其人工繁育成功率具有重要意义。

在鱼类保护生物学领域，金吉罗鱼(Tor putitora)作为具有重要生态旅游价值的大型鲤科鱼类，其种群数量正面临严峻挑战。这种被誉为"顶级游钓鱼类"的物种，由于过度捕捞、栖息地丧失等因素，已被世界自然保护联盟(IUCN)列为濒危物种。实现该物种可持续保护的关键在于人工繁育技术的突破，然而早期发育阶段的高死亡率始终是制约其规模化生产的瓶颈。研究表明，鱼类早期发育过程中基因表达的动态变化与免疫系统发育密切相关，但准确解析这些变化需要可靠的分子生物学工具。

印度农业研究委员会-冷水渔业研究中心(ICAR-DCFR)的研究团队注意到，实时定量PCR(qPCR)作为基因表达研究的金标准，其数据准确性高度依赖于内参基因的选择。然而在金吉罗鱼研究中，尚未建立适用于其早期发育阶段的标准化内参基因体系。这一问题可能导致免疫相关基因表达数据的偏差，进而影响对鱼类幼虫健康状态的准确评估。为此，研究人员开展了一项系统研究，成果发表在《Aquaculture Science and Management》期刊上。

研究团队采用多算法整合的研究策略，主要运用了实时定量PCR技术、生物信息学分析以及统计学算法验证。从金吉罗鱼11个早期发育阶段(包括6个胚胎期和5个幼虫期)采集样本，每个时间点设置6个生物学重复。通过TRIzol法提取总RNA，经质量检测合格后反转录为cDNA。针对6个候选内参基因(18S、ef1a、actb、rpn1、rpl8和s11)设计特异性引物，进行qPCR扩增和熔解曲线分析。最后运用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Cq和RefFinder五种算法综合评价基因表达稳定性。

研究结果部分，"表达谱分析与引物特异性验证"显示，所有候选内参基因的扩增效率均在100-110%之间，熔解曲线呈现单峰，证实引物特异性良好。18S核糖体RNA表现出最高的表达丰度(平均Cq=7.9)，而s11的表达水平最低(平均Cq=32.5)。

在"多算法稳定性评估"部分，geNorm分析将rpn1和18S列为最稳定基因对(M值<0.8)；BestKeeper则基于变异系数(CV)判定rpn1稳定性最佳(CV=0.81%)；NormFinder的ANOVA模型显示actb稳定性最高(稳定性值=0.414)；Delta Cq方法同样支持actb的稳定性优势。最终通过RefFinder整合分析，确立actb为最优内参基因，其次为rpn1和18S。

"内参基因验证应用"部分，研究人员选择补体成分C3和白细胞介素-1β(il-1β)两个免疫基因进行验证。结果显示，使用actb、rpn1或18S标准化时，免疫基因表达模式高度一致；而使用稳定性较差的s11标准化时，则出现明显的表达量高估现象，证实了内参基因选择对结果解读的关键影响。

这项研究首次建立了金吉罗鱼早期发育阶段的标准化内参基因体系，解决了该领域长期缺乏可靠分子基准的难题。研究不仅为深入解析金吉罗鱼发育免疫学提供了关键工具，其多算法验证的研究范式也可推广至其他鱼类物种。特别值得注意的是，β-肌动蛋白(actb)的稳定性在多种鱼类发育研究中得到验证，暗示细胞骨架相关基因可能具有跨物种的稳定性特征。这一发现为鱼类发育生物学研究的内参基因选择提供了重要参考。研究成果对提高金吉罗鱼人工繁育成功率、制定科学的幼虫健康管理策略具有重要应用价值，也为其他濒危鱼类的保护研究提供了方法学借鉴。