基于PCR-侧向流动试纸条技术的MC4R基因SNP快速可视化分型方法开发及其在湖羊育种中的应用

本研究针对动物育种中SNP分型效率低下的问题，开发了一种基于PCR-侧向流动试纸条(PCR-LFD)的MC4R基因g.732 C>G位点快速检测技术。研究人员通过设计LNA修饰的特异性引物，结合全血直接扩增和免疫层析技术，实现了CC、CG、GG基因型的可视化区分。该方法无需DNA提取和电泳检测，1.5小时内即可完成分型，与测序结果100%吻合，为畜禽分子育种提供了高效便捷的技术工具。

在畜禽分子育种领域，单核苷酸多态性(SNP)检测技术的效率直接影响育种进程。传统SNP分型方法如测序、基因芯片等存在设备依赖性强、耗时长等缺陷，难以满足现场快速检测需求。特别是对于MC4R基因这类与动物生长性状密切相关的候选基因，其SNP位点g.732 C>G已被证实与湖羊体高显著相关，但现有检测技术无法实现育种现场的即时分型。

浙江省农业科学院的研究人员创新性地将聚合酶链式反应(PCR)与侧向流动试纸条(LFD)技术相结合，开发出全血直扩式SNP可视化检测系统。该研究选择MC4R基因g.732 C>G作为靶标，在引物3'端SNP位点引入锁核酸(LNA)修饰增强特异性，5'端分别标记生物素(BIOTIN)和异硫氰酸荧光素(FITC)。通过优化反应体系，实现全血样本直接扩增后LFD检测，避免了DNA提取和电泳分析步骤。相关成果发表在《Scientific Reports》期刊。

关键技术包括：(1)设计LNA修饰的等位基因特异性引物，针对g.732 C>G位点分别设计MC4R-732-F-C和MC4R-732-F-G引物；(2)建立全血直接PCR扩增体系，采用温度梯度优化确定63℃为最佳退火温度；(3)开发双标记(LFD)检测系统，通过BIOTIN-FITC标记物与试纸条上抗体结合实现可视化判读；(4)使用24份湖羊血样进行方法验证。

材料与方法

研究获得浙江省农科院伦理委员会批准，采集杭州鹏达农业开发有限公司标准化饲养的湖羊颈静脉血样。引物设计采用DNAMAN 8.0软件，在SNP位点3'端引入LNA修饰，上游引物5'端加BIOTIN标记，下游引物5'端加FITC标记。PCR使用马拉松DNA聚合酶，扩增产物为254bp。

结果

引物特异性验证

温度梯度实验显示，55-63℃下引物能特异性扩增对应基因型，65℃时条带减弱。错配实验证实LNA修饰可完全阻断非目标基因型扩增。

PCR-LFD体系建立

CC基因型样本仅与MC4R-732-F-C引物产生T线显色，GG基因型仅与MC4R-732-F-G引物反应，杂合型则双引物均显色。全血与DNA模板检测结果完全一致。

实际样本验证

24份湖羊血样检测结果与测序分型完全一致，证实该方法可靠性。

该研究建立的PCR-LFD技术突破传统SNP检测方法局限，通过三大创新实现技术革新：LNA修饰增强引物特异性、全血直扩简化前处理、双标记LFD实现可视化读值。相较于常规方法，检测时间从6-8小时缩短至1.5小时，成本降低约70%，且无需专业设备支持。在湖羊育种实践中，该方法可应用于发情期配种筛选、幼畜早期选育等关键环节，为分子标记辅助育种提供强有力的技术支撑。未来通过引物组合优化，该平台可扩展至多SNP位点联合检测，在畜禽遗传改良领域具有广阔应用前景。