整合蛋白质序列设计与进化保守性分析揭示红光光敏色素光谱调控位点

研究人员开发了功能-结构-适应性(FSA)分析流程，结合ProteinMPNN序列设计与自然进化保守性分析，成功鉴定了红光光敏色素(BphPs)中调控光谱特性和热回复特性的关键位点。该研究通过体外实验验证了GAF结构域β转角区域(170-176位)作为新型变构调控网络节点的重要性，为理解光敏蛋白家族复杂的信号转导机制提供了新视角。

　　

在生命科学领域，理解蛋白质如何通过精细的氨基酸相互作用实现复杂功能始终是核心挑战。红光光敏色素作为自然界广泛存在的光开关蛋白，其独特的红光/远红光响应特性在植物光形态建成和微生物光信号转导中发挥关键作用。然而，这类蛋白的构象变化与光谱特性调控机制仍存在诸多未解之谜，特别是第二壳层残基如何通过变构效应影响光循环特性的分子基础尚不明确。

奥地利格拉茨理工大学(Institute of Biochemistry, Graz University of Technology)的Oliver Maximilian Eder等研究人员在《Structure》发表创新性研究，开发了功能-结构-适应性(Function-Structure-Adaptability, FSA)分析流程。该方法通过比较ProteinMPNN设计的"理想化"序列与自然进化序列的保守模式，成功区分了结构稳定性和功能特异性残基。研究者选择非典型光敏色素IsPadC作为模型，结合紫外可见光谱、荧光光谱和氢氘交换质谱(HDX-MS)等技术，揭示了GAF结构域中先前未被认识的调控网络。

关键技术方法包括：1) 多状态ProteinMPNN序列设计结合进化保守性分析的FSA流程；2) 靶向突变体的光谱学表征；3) 构象动态分析的HDX-MS技术；4) 二聚体结构的AlphaFold2预测与晶体结构验证。

【FSA工作流程与类别定义】

研究团队建立的FSA流程通过统计比较自然序列与ProteinMPNN生成序列的位置特异性差异，将残基分为三类：1) 功能类（自然序列保守但被ProteinMPNN忽略，如Asp^DIP）；2) 结构类（两者均保守，如Phe195）；3) 适应类（自然序列多样但ProteinMPNN保守）。在IsPadC光敏模块514个氨基酸中，10.7%被标记为功能类，27.2%为结构类，15.2%为适应类。

【验证BV配体环境与第二壳层残基】

通过将IsPadC特有的Met190-Phe259对突变为典型光敏色素常见的Tyr-Met组合(M190Y/F259M)，发现其光稳态中Pfr比例显著增加。这表明第二壳层残基通过π-π堆叠等相互作用影响D环翻转和Pfr稳定性。

【β转角区域调控热回复特性】

GAF结构域β1-β2转角(170-175位)的突变体表现出截然不同的热回复动力学：W174G突变使回复速率降低10倍以上，而N175A突变则加速5-10倍。HDX-MS显示这些突变通过破坏Trp174-Arg205阳离子-π堆叠或Asn175与PASDIP基序的氢键，改变了PHY舌区和PASDIP等关键信号转导元件的构象动态。

该研究的重要发现在于揭示了光敏色素中远离发色团的二级结构元件如何通过变构网络调控光响应特性。特别值得注意的是，GAF结构域的β转角区域作为"分子变阻器"，通过精细调节构象动态平衡影响整个蛋白的信号转导效率。FSA方法的创新性在于克服了传统共进化分析难以区分功能与结构残基的局限，为蛋白质工程和功能注释提供了新工具。研究结果不仅深化了对光敏色素分子机制的理解，其方法论对研究其他变构调控蛋白也具有广泛适用性。