不同聚合度原花青素通过TLR4受体调控Caco-2细胞单层紧密连接蛋白表达的差异性机制研究

本研究针对原花青素(PACs)聚合度(DP)差异对肠道屏障功能的影响机制这一科学问题，通过建立分化期Caco-2细胞模型，结合分子对接技术，首次揭示低聚合度PACs(DT-PAC)通过抑制TLR4/NF-κB通路增强屏障蛋白ZO-1/claudin-3表达，而高聚合度PACs(PPAC)则激活该通路导致屏障破坏。研究为精准开发肠道屏障保护型PACs制剂提供了重要理论依据。

　　

肠道作为人体最大的免疫器官，其屏障功能的完整性对维持机体健康至关重要。紧密连接(TJ)蛋白构成的"分子栅栏"是调控肠道通透性的关键结构，其表达异常与炎症性肠病、代谢性内毒素血症等多种疾病密切相关。原花青素(PACs)作为膳食中含量最丰富的多酚类物质，既往研究多聚焦其抗氧化和抗炎作用，但关于不同聚合度(DP)PACs对肠道屏障功能的差异性影响机制仍存在重大知识空白。尤其值得关注的是，处于分化期的肠道上皮细胞（约占肠上皮总量的20%）对屏障功能维持具有特殊意义，但相关研究几乎空白。

加拿大达尔豪斯大学(Dalhousie University)农业学院植物食品与环境科学系的Wasitha P.D.W. Thilakarathna团队在《Archives of Biochemistry and Biophysics》发表的重要研究，首次系统揭示了PACs聚合度差异通过TLR4受体调控分化期Caco-2细胞单层紧密连接蛋白表达的分子机制。研究人员采用分级色谱法从葡萄籽中分离出5种不同DP的PACs组分（DT-PAC二聚体/三聚体、OPAC-1五聚体/六聚体、OPAC-2八聚体/十二聚体、PPAC-1 13-15亚基、PPAC-2 20亚基），通过建立分化期Caco-2细胞模型，结合FITC-葡聚糖渗透实验、Western blotting和分子对接等技术，阐明了PACs DP依赖性调控肠道屏障功能的双重作用机制。

关键技术方法包括：(1)采用超声辅助丙酮-甲酸体系提取葡萄籽PACs，通过乙醇-丙酮梯度洗脱获得不同DP组分；(2)建立8天分化期Caco-2细胞单层模型模拟再生肠上皮；(3)FITC-葡聚糖渗透实验定量评估单层完整性；(4)Western blotting检测ZO-1、claudin-1/2/3等TJ蛋白表达；(5)AutoDock Vina模拟PAC二聚体/十聚体与TLR4/MD-2复合物的相互作用。

研究结果：

3.1 PACs组分表征

成功分离的PACs中二聚体/三聚体占比超90%，PPAC-2组分平均DP达19.93。DMAC法测定各组分PAC含量，建立标准化实验体系。

3.2 细胞毒性

OPAC-1(五聚体/六聚体)在25μg/mL时使细胞活力降至70%，显著高于其他组分。据此选择5/25μg/mL作为后续实验浓度。

3.3 单层渗透性

PPAC-1/PPAC-2分别使FITC-葡聚糖渗透率增加7%/10%，显著破坏单层完整性，而DT-PAC和OPACs无显著影响。

3.4 TJ蛋白表达

Western blotting显示：DT-PAC显著上调屏障蛋白ZO-1(1.8倍)和claudin-3(1.5倍)；PPACs则下调ZO-1/claudin-3同时上调孔道蛋白claudin-2；OPACs呈现双重效应，同步增加claudin-1(屏障型)和claudin-2(孔道型)。

3.5 分子对接

发现PAC十聚体以-8.1kcal/mol结合能部分嵌入MD-2腔体，其头部延伸至TLR4界面形成氢键(Asn360/Asp379)，可能促进TLR4/MD-2二聚化；而二聚体完全嵌入MD-2腔体，可能竞争性抑制TLR4激活。

研究结论与意义：

该研究首次阐明PACs调控肠道屏障功能的DP依赖性机制：低DP PACs(DT-PAC)通过拮抗TLR4/MD-2抑制NF-κB活化，上调ZO-1/claudin-3增强屏障；高DP PACs(PPAC)则作为TLR4/MD-2激动剂激活NF-κB通路，通过"下调屏障蛋白+上调孔道蛋白"双重作用破坏屏障。这一发现为解释既往关于PACs肠道保护作用的争议性报道提供了关键机制证据——商业PAC提取物中90%为低DP组分可能掩盖PPAC的负面效应。

研究创新性地提出"PACs聚合度-肠道屏障功能"的量效关系模型，为开发靶向TLR4的精准营养干预策略奠定基础：针对炎症性肠病等屏障缺陷疾病，可选用DT-PAC组分；而需避免高DP PACs在肠上皮再生期的潜在危害。研究还建立了分化期Caco-2细胞模型，为评估营养物质对肠上皮再生过程的影响提供了新方法学范式。未来研究可进一步通过TLR4基因沉默实验验证该机制，并探索PACs与其他模式识别受体的互作网络。