Aureobasidium pullulans发酵产胞外多糖的迭代统计优化策略及其工业应用潜力

本研究针对生物基可降解聚合物替代化石基材料的产业需求，通过迭代式统计优化（OFAT-PBD-RSM）策略优化Aureobasidium pullulans发酵生产胞外多糖（EPS）pullulan的工艺。研究人员采用DBTL循环模式，将摇瓶产量提升6.34倍至113.5±3.5 g/L，创野生菌株最高纪录，为降低生物聚合物生产成本提供了创新方案。

　　

在化石燃料资源日益枯竭的背景下，生物基可降解聚合物成为替代传统塑料的重要选择。其中，由Aureobasidium pullulans（出芽短梗霉）产生的胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）——普鲁兰多糖（pullulan）因其独特的α-1,6-糖苷键结构，展现出优异的成膜性、粘附性和生物降解性，在食品包装、医药载体和化妆品等领域具有广阔应用前景。然而，当前生产工艺面临三大瓶颈：黑色素副产物干扰、高底物浓度抑制效应以及发酵液高粘度导致的成本问题，这使得pullulan的工业化生产始终难以突破效率瓶颈。

针对这一挑战，德国慕尼黑工业大学（Technical University of Munich）生物技术与可持续发展校区生物过程工程系的Venessa Dsouza团队在《Biotechnology Reports》发表了一项创新研究。研究人员采用"设计-构建-测试-学习"（Design-Build-Test-Learn, DBTL）循环模式，通过三阶段迭代优化策略，将野生型A. pullulans DSM 3042的pullulan产量提升至113.5±3.5 g/L，这是目前报道的野生菌株在摇瓶培养中的最高产量，较初始产量提升6.34倍。

研究团队运用了三个关键技术方法：首先采用单因素实验（One Factor at A Time, OFAT）确定基础参数；随后通过Plackett-Burman设计（PBD）筛选显著影响因子；最后利用响应面法（Response Surface Methodology, RSM）解析多因子交互作用。实验设计涵盖碳源类型、pH值、培养时间等变量，特别关注了蔗糖浓度（5-20% w/v）与氮源（酵母提取物YE）的协同效应。

3.1 OFAT基础优化

通过测试葡萄糖、蔗糖等六种碳源，确认蔗糖最优（17.9±0.8 g/L），pH 6和4天培养期为初始最佳条件。值得注意的是，粗原料（甘蔗糖蜜和甘油）直接使用效果不佳，提示预处理必要性。

3.2 迭代统计优化

T1阶段发现蔗糖、K₂HPO₄和YE显著影响产量，其中8.682%蔗糖与0.016% YE组合使产量翻倍至39 g/L。pH与接种量实验揭示酸性环境（pH 4）和大接种量（22.07%）的优势。

T2阶段扩大参数范围后，20.07%蔗糖与1.5% K₂HPO₄组合产量达70.5±1.5 g/L，证实菌株具有罕见的高渗透压耐受性。

T3阶段首次整合培养基与培养条件优化，发现pH与蔗糖交互作用主导生产，15%蔗糖+pH 4.5+0.0255% (NH₄)₂SO₄组合产量达88.7±2.5 g/L。

3.3 终工艺验证

延伸培养至6天并使用20%蔗糖+22%接种量，最终产量突破113.5±3.5 g/L。FTIR表征（3308.43 cm^-1羟基特征峰）证实产物与标准pullulan结构一致。

这项研究通过系统优化创造了野生菌株pullulan产量的新纪录，其创新性体现在：首次采用迭代式DBTL循环逐步逼近最优解；发现DSM 3042菌株对20%高蔗糖浓度的独特耐受性；证实低氮条件（0.0255% (NH₄)₂SO₄）可触发EPS合成信号。研究为生物聚合物规模化生产提供了可复用的优化框架，未来结合补料分批策略和生物反应器参数优化，有望进一步降低生产成本，加速pullulan在包装、医药等领域的商业化应用。