欧洲文昌鱼功能基因组学研究：CRISPR/Cas9高效编辑揭示Ascl1/2.1对周围神经系统发育的关键作用

本研究首次在欧洲文昌鱼(B. lanceolatum)中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系，通过靶向敲除bHLH转录因子Bl-Ascl1/2.1基因，证实其对表皮感觉神经元(ESN)发育的关键调控作用。研究者创新性地采用受精卵显微注射RNP复合物方法，成功获得F0代嵌合突变体，为这一重要进化发育生物学(EvoDevo)模型的功能基因组学研究奠定基础。

研究亮点

• 首次在欧洲文昌鱼B. lanceolatum建立CRISPR/Cas9编辑系统

• 开发受精卵阶段显微注射核糖核蛋白(RNP)复合物的新方法

• 揭示Ascl1/2.1对表皮感觉神经元(ESN)发育的关键作用

• 通过mRNA回补实验验证表型特异性

靶向突变Bl-Ascl1/2.1的CRISPR/Cas9系统

Bl-Ascl1/2.1基因包含两个外显子，其中第一个外显子编码bHLH结构域。我们设计了两个特异性单导RNA(sgRNA)：Bl-Ascl-sg01靶向该结构域上游区域，Bl-Ascl-sg02则直接靶向结构域内部（图1A）。我们改良了源自海鞘(Phallusia mammillata)的实验方案，通过显微注射将sgRNA/Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物导入受精卵而非未受精卵。

受精卵显微注射CRISPR/Cas9 RNP复合物：B. lanceolatum功能研究新突破

本研究首次证明，通过向受精卵注射靶向原神经基因Bl-Ascl1/2.1的CRISPR/Cas9 RNP复合物，可在欧洲文昌鱼中高效产生F0代嵌合突变体。与常规的未受精卵注射方法不同（该方法在B. floridae中因sgRNA降解导致效率低下），我们的受精卵注射策略成功克服了这一技术瓶颈。

结论

本研究成功建立了欧洲文昌鱼B. lanceolatum的CRISPR/Cas9基因编辑平台，通过靶向敲除Bl-Ascl1/2.1基因，证实其在表皮感觉神经元发育中的关键作用。这一技术突破为后续利用这一重要EvoDevo模型开展功能基因组学研究铺平了道路。